Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen der Phenazin- und Furanonaphthochinon I-Biosynthese in Streptomyces cinnamonensis DSM 1042

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-29469
http://hdl.handle.net/10900/49067
Dokumentart: Dissertation
Date: 2007
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Pharmazie
Advisor: Heide, Lutz
Day of Oral Examination: 2007-07-19
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Phenazin
Other Keywords: Streptomyces cinnamonensis , Prenyltransferase , Antibiotika , Furanonaphthochinon
Streptomyces cinnamonensis , prenyltransferase , phenazine , antibiotics , furanonaphthoquinone
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Inhaltszusammenfassung:

Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 produziert zwei Arten von prenylierten Sekundärstoffen: Furanonaphthochinon I (FNQ I) und prenylierte Phenazine, insbesondere Endophenazin A. FNQ I ist ein Naphthochinon aus dem Polyketidstoffwechsel mit einem zyklisierten Geranylrest. Endophenazin A ist ein Phenazin-1-carbonsäurederivat mit einem Dimethylallylrest an Position 9. Zu Beginn dieser Arbeit waren einige Phenazin-Biosynthesegencluster aus verschiedenen Organismen, vor allem aus Pseudomonas-Stämmen bekannt, jedoch keines für prenylierte Phenazine und noch keines aus Streptomyces oder anderen Actinomyceten. Daher sollte in der vorliegenden Arbeit nach dem Biosynthesegencluster für Endophenazin A in Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 gesucht werden. Es wurde eine Cosmidbank von Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 erstellt, mit esmA, einem Gen aus dem Esmeraldin-Biosynthesegencluster von Streptomyces antibioticus Tü2706 gescreent und schließlich das Insert von Cosmid 3-6H komplett sequenziert. Sequenzanalyse dieses DNA-Abschnittes ergab 31 offene Leserahmen (Orfs), darunter sechs putative Phenazin-Biosynthesegene, zwei putative Prenyltransferasegene und ein putatives Methyltransferasegen. Außerdem wurden einige Orfs mit hoher Sequenzähnlichkeit zu Genen aus dem Biosynthesegencluster von Furaquinocin gefunden, unter anderem ein putatives Mevalonatkinasegen. Durch Inaktivierung der beiden putativen Prenyltransferasegene fnq26 und fnq28 gelang der Nachweis, dass Fnq26 in die Biosynthese von FNQ I involviert ist, wohingegen die Funktion von fnq28 unklar bleibt. Deletion aller neun Gene von fnq26 bis einschließlich ephzA zeigte, dass dieser Genabschnitt einschließlich der sechs putativen Phenazin-Biosynthesegene an der Biosynthese von Phenazin-1-carbonsäure und Endophenazin A beteiligt ist. Fnq26 wurde in E. coli als His8-Tag Protein überexprimiert und mit Hilfe der NTA-Nickelaffinitätschromatographie gereinigt. Fnq26 katalysiert die Geranylierung von Flaviolin, 1,3-Dihydroxynaphthalin und 4-Hydroxybenzoat. Die enzymatischen Produkte wurden über präparative HPLC isoliert und deren Strukturen mittels spektroskopischer Methoden (MS und NMR) aufgeklärt. Fnq26 katalysiert sowohl C- als auch O-Prenylierungen und ist zudem in der Lage, eine sog. „reverse“ Prenylierung durchzuführen, bei der die Verknüpfung des Geranyldiphosphates (GPP) mit dem aromatischen Substrat über C-3 des Prenyldiphsophates anstatt über C-1 stattfindet. Desweiteren wurden die biochemischen Eigenschaften, die kinetischen Parameter und die Ionenabhängigkeit der enzymatischen Aktivität untersucht. Fnq26 ist ein lösliches, monomeres Enzym von 39,1 kDa. Für 1,3-Dihydroxynaphthalin ergab sich ein Km-Wert von 1,9 mM und für Flaviolin von 21 µM. Für 4-Hydroxybenzoat wurde ein Km-Wert von ungefähr 5,6 mM bestimmt. Der Km-Wert für GPP betrug 2,1 µM unter Verwendung von Flaviolin und 27 µM unter Verwendung von 1,3-Dihydroxynaphthalin als Prenylakzeptor. Die Wechselzahl betrug für 1,3-Dihydroxynaphthalin 0,2 min-1, für 4-Hydroxybenzoat 0,14 min-1 und für Flaviolin 0,013 min-1. Sequenzvergleiche zeigten, dass Fnq26 zu einer erst kürzlich identifizierten Gruppe von löslichen, aromatischen Prenyltransferasen gehört. Wie bei CloQ aus der Clorobiocin-Biosynthese, aber im Gegensatz zu Orf2 aus der Naphterpin-Biosynthese und zu allen trans-Prenyltransferasen ist die enzymatische Aktivität von Fnq26 von der Anwesenheit von zweiwertigen Kationen unabhängig. Die Anwesenheit eines einzelnen putativen Mevalonatkinasegens im sequenzierten Bereich von Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 warf die Frage nach dem biosynthetischen Ursprung der Isoprenoideinheiten von FNQ I und Endophenazin A auf. Für die Biosynthese von Isopentenyldiphosphat über den Mevalonatweg sind neben der Mevalonatkinase fünf weitere Enzyme erforderlich, deren Gene aber nicht im Biosynthesegencluster enthalten waren. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von G. Bringmann, Universität Würzburg, wurde dieser Frage in zwei Fütterungsexperimenten nachgegangen. Durch Fütterung von [13C2]Acetat wurde gezeigt, dass sowohl der Dimethylallylrest von Endophenazin A als auch der Geranylrest von FNQ I hauptsächlich aus dem Mevalonatstoffwechsel stammen. Ein zweites Fütterungsexperiment mit [2-13C]Glycerol bewies, dass es einen zusätzlichen Beitrag des Methylerythritolphosphatweges (MEP) zur Bereitstellung der Isopreneinheit von FNQ I gibt. Anhand der Einbauraten der [13C]-Markierung an verschiedenen Positionen des FNQ I- Moleküls wurden der Beitrag des Mevalonatweges zur Isoprenoidbiosynthese auf 80% und der Anteil des MEP-Weges auf 20% geschätzt. Durch die [13C2]Acetatfütterung konnte zudem gezeigt werden, dass in der Biosynthese von FNQ I ein symmetrisches Zwischenprodukt entstehen muss. Wahrscheinlich handelt es sich um 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalin, was bedeutet, dass die Prenylierung erst nach Bildung dieses Intermediates stattfinden kann.

Abstract:

Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 produces two classes of prenylated secondary metabolites: furanonaphthoquinone I (FNQ I) and prenylated phenazines, predominantly endophenazine A. FNQ I is a naphthoquinone from the polyketide pathway with a cyclic geranyl side chain. Endophenazine A is a phenazine-1-carboxylic acid derivative with a dimethylallyl side chain in position 9. At the beginning of this thesis several biosynthetic gene clusters for phenazines from Pseudomonas and from only few other organisms were already known, but no phenazine biosynthetic gene cluster from Streptomyces or other actinomycetes and no gene cluster for prenylated phenazines have been published at that time. Therefore, the biosynthetic gene cluster for endophenazine A from Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 was investigated. A cosmid library was prepared from genomic DNA of Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 by using the SuperCos1 vector. In order to identify cosmids carrying phenazine biosynthetic genes, the library was screened with esmA from the esmeraldine biosynthetic gene cluster from Streptomyces antibioticus Tü2706 and finally cosmid 3-6H was selected for full-length sequencing. Sequence analysis of the cosmid insert revealed 31 open reading frames (Orfs). Six putative phenazine biosynthetic genes, two putative prenyltransferase genes and one methyltransferase gene were identified. Furthermore several Orfs with high similarity to genes from the furaquinocin biosynthetic gene cluster were found, among others a putative mevalonate kinase gene. Gene inactivation experiments of fnq26 and fnq28 confirmed the involvement of Fnq26 in the biosynthesis of FNQ I, whereas the role of Fnq28 is still unclear. Deletion of the nine Orfs from fnq26 to ephzA confirmed, that this region comprising the six putative phenazine biosynthetic genes, is involved in endophenazine A and phenazine-1-carboxylic acid biosynthesis. Fnq26 was overexpressed as His8-tag-protein in E. coli and purified by Ni2+ affinity chromatography. Fnq26 catalyzes the geranylation of flaviolin, 1,3-dihydroxynaphthalene and 4-hydroxybenzoic acid. The enzymatic products were purified by preparative HPLC and their structures were elucidated by spectroscopic methods (MS and NMR). Fnq26 catalyzes C-and O-prenylations. Additionally Fnq26 is capable of attaching C-3 rather than C-1 of the geranyl diphosphate (GPP) to the aromatic substrate, a so called “reverse” prenylation. The biochemical properties, the kinetic parameters and the dependency on the presence of metal ions of the prenyltransferase Fnq26 were investigated. Fnq26 is a soluble, monomeric protein of 39.1 kDa. The Km value for 1,3-dihydroxynaphthalene was determined as 1.9 mM and for flaviolin as 21 µM. A Km value of approximately 5.6 mM was obtained for 4-hydroxybenzoic acid. Using flaviolin as aromatic substrate the Km value for GPP was determined as 2.1 µM. When using 1,3-dihydroxynaphthalene as prenyl acceptor a Km value of 27 µM was obtained for GPP. The turnover for 1,3-dihydroxynaphthalene was determined as 0.2 min-1, for 4-hydroxybenzoate as 0.14 min-1 and for flaviolin as 0.013 min-1. Sequence analysis showed, that Fnq26 belongs to a recently discovered class of soluble enzymes that catalyze the prenylation of small aromatic substrates. In contrast to Orf2 from the naphterpin biosynthesis and to all trans-prenyltransferases, the catalytic activity of Fnq26 is independent on the presence of divalent cations, similar as observed for CloQ from the clorobiocin biosynthesis. The sequenced DNA region of Streptomyces cinnamonensis DSM 1042 contains a putative mevalonate kinase gene. This raised the question about the biosynthetic origin of the isoprenoid moieties of FNQ I and endophenazine A. For the formation of isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate via the mevalonate pathway another five enzymes are necessary, but the entire biosynthetic gene cluster of FNQ I does not contain these five mevalonate pathway genes. In cooperation with the group of G. Bringmann, University of Würzburg, this question was investigated by two different feeding experiments. The results of the feeding experiment with [13C2]acetate proved that the isoprenoid building blocks of both compounds are predominantly formed via the mevalonate pathway. Using [2-13C]glycerol as labeled precursor it was shown, that the [13C]label was incorporated in the corresponding positions of the FNQ I molecule via the mevalonate pathway and as well via the methyl-erythritol phosphate pathway (MEP). The relative contribution of the two pathways to FNQ I biosynthesis was estimated by the enrichment ratio as 20% from the MEP pathway and 80% from the mevalonate pathway. The incorporation pattern of [13C2]acetate suggested, that FNQ I biosynthesis involves a symmetric polyketide intermediate, probably 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene and that the prenylation reaction can occur only after the formation of this symmetric intermediate.

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