Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese der Aminocoumarin-Antibiotika Novobiocin und Clorobiocin

Abstract

Die Aminocoumarin-Antibiotika Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1 sind potente Hemmer der bakteriellen Gyrase. Bisher blieb allerdings die klinische Anwendung auf Grund der schlechten Wasserlöslichkeit, ihrer geringen Aktivität gegen Gram-negative Bakterien sowie ihrer relativ hohen Toxizität gegenüber eukaryontischen Zellen eingeschränkt. Auch ihr potentieller Einsatz als Zytostatika wird diskutiert und untersucht. Um die bisherigen Einschränkungen der Anwendung als Antibiotika zu überwinden und die Anwendung als Zytostatika zu untersuchen, ist es notwendig, neue, strukturell modifizierte Aminocoumarine herzustellen und deren Eigenschaften zu untersuchen.

Clorobiocin trägt am Desoxyzucker eine 5-Methylpyrrol-2-carbonsäure-Gruppe, die essentiell für die Hemmung der bakteriellen Gyrase ist. Die Biosynthese dieser wichtigen Einheit des Moleküls wurde in früheren Arbeiten durch Inaktivierungen und biochemischen Untersuchungen der Gene cloN1-N7 (bzw. couN1-N7) aufgeklärt. Das Gen cloN6 codiert für die Methyltransferase, welche die Methylgruppe auf die Position 5 der Pyrrol-2-carbonsäure überträgt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte versucht werden, die Methyltransferase CloN6 biochemisch zu untersuchen. Dazu wurde das Gen cloN6 in verschiedene Expressionsvektoren kloniert und Expressionsversuche durchgeführt. Es konnte aber auch nach umfassenden Versuchen das vollständige CloN6-Protein nicht gewonnen werden. Dadurch war eine biochemische Untersuchung des Proteins nicht möglich.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Herstellung neuer Aminocoumarine. Die Aminocoumarine Novobiocin und Clorobiocin enthalten eine prenylierte 4-Hydroxybenzoesäure (Ring A). Es sollten nun neue Novobiocin- und Clorobiocin-Derivate hergestellt werden, die statt der prenylierten 4-Hydroxybenzoesäure ein Analogon tragen. Außerdem sollten Hybrid-Aminocoumarine hergestellt werden, die Strukturmerkmale von Clorobiocin und Novobiocin aufweisen und ebenfalls Analoga der prenylierten 4-Hydroxybenzoesäure tragen.

Bei der Herstellung von Novobiocin-Analoga wurde zunächst eine enzymatische Herstellung angestrebt. Dazu wurde Novenamin zusammen mit der prenylierten 4-Hydroxybenzoesäure in Amidsynthetase-Assays eingesetzt. Jedoch wurde Novenamin in den Assays nicht als Substrat akzeptiert. Um durch Mutasynthese neue Novobiocin-Derivate herzustellen, wurden auch verschiedene novQ-Defektmutanten hergestellt, die keine prenylierte 4-Hydroxybenzoesäure herstellen konnten. Bei allen diesen Inaktivierungen trat eine Beeinträchtigung der Zuckerbiosynthese auf, wodurch nach Zufütterung von Ring A nur Produkte ohne Desoxyzucker resultierten. Somit konnten durch diese Methode keinen neuen Novobiocin-Derivate gewonnen werden.

Clorobiocin-Derivate wurden bisher unter anderem durch Mutasynthese hergestellt. Jedoch war diese Methode limitiert durch die Substratspezifität der Amidsynthetase CloL. Ein Ziel dieser Arbeit war diese Limitierung aufzuheben und neue Clorobiocin-Derivate herzustellen. Durch das Herstellen einer heterologen Clorobiocin Mutante, in der die Biosynthese der prenylierten 4-Hydroxybenzoesäure blockiert war und zusätzlich das Gen für die Amidsynthetase cloL inaktiviert wurde, war es möglich die fremde Amidsynthetase couL aus dem Coumermycin-Cluster bzw. simL aus dem Simocyclinon-Cluster einzubringen. Anschließend wurden Ring A-Analoga gefüttert, die nicht oder nur schlecht von der natürlichen Amidsynthetase CloL akzeptiert wurden. Die neue Clorobiocin-Derivate wurden isoliert und mittels 1H NMR und ESI-MS identifiziert.

Um Hybrid-Aminocoumarine herzustellen, wurde eine weitere Methode entwickelt. Dazu wurde eine Mutante des Novobiocin-Produzenten, die nur die 3-Amino-4,7-dihydroxycoumarin-Gruppe produzierte, mit verschiedenen Ring A-Analoga gefüttert, von denen bekannt war, dass sie von NovL akzeptiert werden. Die resultierenden Aglyka wurden anschließend an eine Mutante des Clorobiocin-Produzenten gefüttert, die ebenfalls inaktiv in der Biosynthese der prenylierten 4-Hydroxybenzoesäure sowie im Amidsynthetase-Gen cloL war und die die Aglyka mit dem Desoxyzucker verknüpfte. Diese Methode wurde anschließend durch das Einbringen der Amidsynthetase-Gene couL bzw. simL in die Novobiocin-Mutante erweitert. Nach Zufütterung von Ring A-Analoga zu dieser Mutante und anschließender Fütterung der entstandenen Aglyka an die Mutante des Clorobiocin-Produzenten resultierten auch hier neue Aminocoumarine. Alle neu entstanden Hybrid-Aminocoumarine wurden isoliert und mittels 1H NMR und ESI-MS identifiziert.

Die neuen Derivate wurden auf ihre gyrasehemmende Aktivität, ihre antimikrobielle Aktivität gegenüber verschiedenen Gram-positiven und Gram-negativen Mikroorganismen und auf ihre Toxizität gegen eukaryontische Zellen untersucht. Außerdem wurde der Wirkungsmechanismus durch Reporter-Gene-Assays untersucht.

The aminocoumarin antibiotics novobiocin, clorobiocin and coumermycin A1 are potent inhibitors of the bacterial gyrase. Although their therapeutic application has been limited by the poor water solubility, low activity against gram-negative bacteria and toxicity against eukaryotic cells. Their use as cytostatic drugs was also discussed and investigated. To overcome the previous limitations and to investigate the use as cytostatic drug it is essential to produce new, structural modified aminocoumarins and to investigate their properties.

Clorobiocin contains a 5-methylpyrrole-2-carboxyl moiety attached to a deoxysugar which is essential for the inhibition of the bacterial gyrase. The biosynthesis of this important moiety was investigated in former studies by inactivation experiments and biochemical studies of the genes cloN1-N7 (and couN1-7, respectively). The gene cloN6 code for a methyltransferase, which is responsible for the methyl group on position 5 of the pyrrole-2-carboxylic acid. Within this thesis the methyltransferase CloN6 should be investigated biochemically. Therefore the gene cloN6 was cloned in different expression vectors and expression experiments have been carried out. In spite of extensive experiments no complete CloN6 protein was obtained. Therefore no biochemical investigation of CloN6 was possible.

A further aim of this thesis was the production of new aminocoumarins. The aminocoumarins novobiocin and clorobiocin contain a prenylated 4-hydroxybenzopic acid (Ring A). New novobiocin and clorobiocin derivatives should be produced which contain in stead of the prenylated 4-hydroxybenzoic acid analogues of this moiety. Additionally, hybrid aminocoumarins should be produced which contain structure characteristics of clorobiocin and novobiocin and which carry analogues of the prenylated 4-hydroxybenzoic acid instead of the genuine Ring A.

For the production of novobiocin analogues an enzymatic synthesis was aimed. Therefore novenamin together with Ring A were used in amide synthetase assays. However, novenamin was not accepted as substrate in these assays. To produce new novobiocin derivatives by mutasynthesis a series of novQ defective mutants were generated which can not produce the prenylated 4-hydroxybenzoic acid any more. In all of these mutants an impairment of the sugar biosynthesis was observed which resulted in the production of derivatives without the deoxysugar after feeding of prenylated 4-hydroxybenzoic acid. As a result, no new novobiocin derivatives were generated.

Among others, clorobiocin derivatives were generated in former studies by mutasynthesis experiments. However this method was limited by the substrate specificity of the amide synthetase CloL. An aim of this work was to abrogate this limitation and to produce new clorobiocin derivatives. By the generation of a heterologous mutant of the clorobiocin producer in which the biosynthesis of the prenylated 4-hydroxybenzoic acid was blocked and in which the amide synthetase gene cloL was also inactivated it was possible to introduce the amide synthetase couL of the coumermycin cluster and simL of the simocyclinone cluster, respectively. Consequently Ring A analogues were fed which were not or only poorly accepted by the amide synthetase CloL. The new clorobiocin derivatives were isolated and identified by 1H NMR und ESI-MS.

Also a method was developed to produce hybrid aminocoumarins. Therefore a mutant of the novobiocin producer was generated which only produce the 3-amino-4,7-dihydroxycoumarin moiety. After feeding of different Ring A analogues, from which were known to be accepted by the amide synthetase NovL, the aglyca were formed. In a second step, the resulting aglyca were fed to a clorobiocin producer mutant in which the biosynthesis of the prenylated 4-hydroxybenzoic acid was blocked and in which the amide synthetase gene cloL was also inactivated. This mutant connected the aglyca with the deoxysugar resulting in new hybrid aminocoumarin antibiotics. Subsequently, this method was enlarged by the introduction of the amide synthetase genes couL and simL, respectively, in the novobiocin mutant. After feeding of Ring A analogues to this mutant and subsequent feeding of the resulted aglyca to the mutant of the clorobiocin producer these experiments resulted in new derivatives as well. All new derivatives were isolated and identified by 1H NMR und ESI-MS.

The new derivatives were tested for their gyrase inhibiting activity, for their antimicrobial activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria and for their toxicity against eukaryotic cells. In addition their mode of action was investigated by reporter-gene assays.