Biochemische Charakterisierung der Funktion der GAF-Domänen der Phosphodiesterase 11A4

Abstract

Hier wurde die Funktion des Tandem-GAF-Ensembles der PDE11A4 untersucht. Als Ligand an die GAF-Domänen wurde das cyclische Nukleotid cGMP gefunden. Dies war möglich, da sich durch die Schaffung eines speziellen Testsystems im Gegensatz zum Holoenzym Ligand und Substrat voneinander unterschieden. Der Einbau des N-terminalen Bereichs der PDE11A4 in die cyanobakterielle Adenylatcyclase CyaB1 erzeugte ein hochempfindliches Testsystem, das die Charakterisierung der PDE11A4 GAF-Domänen und seines N-Terminus durch Messung der enzymatischen Aktivität der Adenylatcyclase ermöglichte. Die Bindung des Liganden erfolgte mit geringer Affinität und sorgte für eine bis zu vierfache Stimulation des katalytischen Zentrums. Die nähere Charakterisierung der GAF-Domänen zeigte, dass GAF-A cGMP bindet und für die Dimerisierung notwendig ist, während für die GAF-B nachgewiesen werden konnte, dass diese keine cGMP bindet, aber für die Ausbildung einer Struktur, die die Signalweiterleitung ermöglicht, essentiell ist. Durch Modifikationen ließ sich die Affinität der GAF-Domänen für cGMP erhöhen. Zum einen durch eine Phosphorylierung eines Serinrestes durch PKG (Ser-162), zum anderen durch eine Proteolyse im Bereich des N-Terminus. Die Phosphorylierung an Ser-162 führte zu einer bis zu vierfachen Affinität der GAF-Domänen für cGMP, während die Phosphorylierung der zweiten Phosphorylierungsstelle im N-Terminus, Ser-117, keinen mit diesem Testsystem messbaren Effekt zeigte. Die imitierte Proteolyse des N-Terminus durch N-terminal verkürzte PDE11A4/CyaB1-Chimären führte zu einer zehn- bis zwanzigfach erhöhten Affinität, wenn mehr als 168 Aminosäuren des N-Terminus entfernt wurden. Eine Untersuchung auf ein Vorkommen dieser Proteolyse in vivo ergab, dass durch das Umsetzen des N-terminalen Bereichs der PDE11A4 mit Homogenaten verschiedener Gewebe eine spezifische Proteolyse stattfand. Spezifisch, da erstens diese Umsetzung bisher nur in humanen Geweben nachgewiesen werden konnte und zweitens der Schnitt lediglich an zwei Positionen innerhalb des N-Terminus erfolgte. Eine massenspektrometrische Analyse zeigte, dass sich die Schnittstellen nahe den beiden Phosphorylierungsstellen lagen. Allerdings entsprachen die Längen der entstandenen Fragmente nicht denen der N-terminalen Bereiche der Chimären mit erhöhter Affinität. Daher ist von einer anderen Funktion als der Erhöhung der Affinität der GAF-Domänen für cGMP auszugehen.

We characterized the function of the GAF tandem domain of phosphodiesterase 11A4 by using a PDE11-cyaB1-AC chimera as a readout system. We found cGMP to be a ligand to the GAF-A domain. Binding occurred with low affinity (EC50: 72.5µM). This affinity could be increased by posttranslational modifications: phosphorylation of the phosphorylation sites within the N-terminal domain increased affinity up to fourfold, proteolysis up to twentyfold.

We also found proteolytic activity of prostate tissue homogenate, causing limited proteolysis within the PDE11A4 N-terminus. This proteolytic acitivity seems to be specific for human tissues, because it could not be detected in several mouse tissues.