Application of Proteases for the Total Enzymatic Synthesis of the Cholecystokinin Octapeptide (CCK-8) using Benzoyl-Arginine as an Enzymatically Cleavable N-Terminal Protecting Group

DSpace Repository


Dateien:

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-28079
http://hdl.handle.net/10900/49027
Dokumentart: Dissertation
Date: 2007
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Chemie
Advisor: Eckstein, Heiner Prof. Dr.
Day of Oral Examination: 2007-04-04
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Enzymatische Peptidsynthese , Cholecystokininoctapeptid , Immobilisiertes Enzyme , Benzoyl-Arginin , Fragmentkondensation
Other Keywords: Enzymatische Peptidsynthese , Cholecystokininoctapeptid , Immobilisiertes Enzyme , Benzoyl-Arginin , Fragmentkondensation
Enzymatic peptide synthesis , Cholecystokinin Octapeptide , Immobilized enzymes , Benzoyl-Arginine , Fragment condensation
License: Publishing license excluding print on demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

Die Vorteile der enzymatischen Peptidsynthese gegenüber klassischen Methoden und der Festphasensynthese können bei den durchgeführten Synthesen voll ausgenutzt werden. Die Reaktionen verlaufen stereo- und regiospezifisch, können einfach kontrolliert und gesteuert werden und die Seitenketten benötigen keinen oder nur minimalen Schutz. Ziel dieser Arbeit ist es, das N-terminal geschützte und freie Cholecystokininoctapeptid (CCK-8) zu synthetisieren. Das Cholecystokininoctapeptid (Asp-Tyr(SO3)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2) ist ein biologisch aktives Peptid. In dieser Arbeit und in unseren früheren Arbeiten wurde die Phenylacetyl (Phac) Schutzgruppe benutzt, aber die Abspaltung hängt von der Sequenz ab und manchmal kann sie überhaupt nicht abgespalten werden. Deshalb wurde als N-terminale Schutzgruppe Benzoylarginin (Bz-Arg) benutzt. Bz-Arg dient als eine mit Trypsin leicht einführbare und wieder abspaltbare Aminoschutzgruppe. Die enzymatische Abspaltung von Bz-Arg vom geschützten CCK-8 ist bedeutsam, weil in der Synthese von CCK-8, entweder die Schutzgruppe überhaupt nicht abgespalten worden ist, oder chemisch gespalten wurde. Abspaltung mit Trypsin ist in diesem Fall möglich wegen der hohen Spezifität von Trypsin nach basischen Aminosäuren. Es spaltet ausschließlich in der P1 Position, und in der Zielsequenz gibt es keine basische Aminosäure. Verschiedene Fragmente von CCK-8 wurden enzymatisch hergestellt. Die N-terminalen Bruchstücke (Bz-Arg-Asp(OEt)-Tyr-Met-OH/OAl) wurden von N nach C schrittweise synthetisiert. Das Pentapeptid ( Phac-Gly-Trp-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2) wird aus Phac-Gly-Trp-Met-OAl und H-Asp(OMe)-Phe-NH2 mit immobilisiertem α-Chymotrypsin aufgebaut. Diese Kupplung ist besser als unsere frühere Methode, in der der Camester benutzt wurde. Durch Vermeiden des Camesters kann die Synthese um drei Schritte verringert werden. Die Phac Gruppe vom Pentapeptid wurde von PGA abgespalten, allerdings in schlechten Ausbeuten. Das geschützte Octapeptid Bz-Arg-Asp(OEt)-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2 wird aufgebaut aus Bz-Arg-Asp(OEt)-Tyr-Met-OAl und Gly-Trp-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2 mit α-Chymotrypsin/Eupergit C in Acetonitril mit einem geringen Wasseranteil. Wie erwartet war die Spaltung von Bz-Arg von Bz-Arg-Asp(OEt)-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2 mit Trypsin bei pH 8,5 erfolgreich. Das isolierte freie Octapeptid wurde mit HPLC und ESIMS überprüft und erwies sich als rein. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die völlig enzymatische Synthese auch eines längeren Peptids möglich ist. Für diese Synthese hat sich die Bz-Arg Gruppe gegenüber den anderen N-terminalen Schutzgruppen in CCK-8 Synthesen als klar besser erwiesen, weil sie leicht mit Trypsin gespalten werden kann.

Abstract:

Enzymes can be used often favorably in organic syntheses, because they can be applied at room or slightly elevated temperature and in aqueous phase. Therefore, enzymatic reactions are economically and environmentally superior to classical organic reactions. Moreover, many side reactions, especially racemization occurring in the chemical peptide synthesis can be avoided and it is not necessary to protect all the side chains of amino acids involved in the coupling. However, there is no general protocol available for the enzymatic reactions therefore each step has to be optimized taking into account substrate structure, concentration, reaction media, temperature and the type of protease. The target octapeptide (CCK-8) is the minimum active sequence with the same biological activity as naturally occurring cholecystokinin and is a potential therapeutic agent in the control of gastrointestinal functions. The objective of this thesis is to synthesize N-terminal protected and deprotected CCK-8. In former investigations the enzymatically cleavable Phac group was used. But in our group it was found that the cleavability depends on the peptide sequence and sometimes can not be cleaved at all. As an alternative Bz-Arg was used as the N-terminal protecting group. This is possible because of the high specificity of trypsin towards basic amino acids in the P1 position and because there is no basic amino acid in the target peptide sequence. This protecting group could be introduced and removed easily with trypsin in test peptides and also in the octapeptide. The enzymatic removal of Bz-Arg from protected CCK 8 is a significant improvement because in the literature of CCK-8 syntheses, either the protecting group (Phac) has not been cleaved at all or is removed chemically. Different fragments of CCK-8 were synthesized, because it was not known in advance which fragment condensation will be successful. The fragments were synthesized using enzymatic methods exclusively. Whenever it was possible, immobilized enzymes were applied. The N-terminal tripeptide fragment of CCK-8 (Bz-Arg-Asp(OEt)-Tyr-Met-OH/OAl) was achieved by the coupling of the individual amino acid derivative towards the C-terminal end of the growing peptide chain. The C-terminal pentapeptide fragment (Phac-Gly-Trp-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2) was prepared by α-chymotrypsin mediated fragment condensation of Phac-Gly-Trp-Met-OAl and Asp(OMe)-Phe-NH2. In an earlier CCK-5 synthesis in our laboratory Phac-Gly-Trp-Met-OEt was first converted to the Cam ester by using three chemical steps and was then coupled with Asp(OMe)-Phe-NH2. Met-OAl could be used as a nucleophile in the extension of the dipetide and was effective enough as an acyl-donor for the 3+2 fragment coupling. With this strategy the earlier method has been improved by reducing the number of steps. The cleavage of Phac group from pepntapeptide was performed with PGA. The final fragment coupling was successful by -chymotrypsin mediated coupling of Bz-Arg-Asp(OEt)-Tyr-Met-OAl and Gly-Trp-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2. As assumed, the cleaving of Bz-Arg from Bz-Arg-Asp(OEt)-Tyr-Met-Gly-Trp-Met- Asp(OMe)-Phe-NH2 with trypsin at pH 8.5 was successful and the isolated product was pure when checked in HPLC and ESIMS. In this thesis it could be demonstrated that the fully enzymatic peptide synthesis even of longer peptides is possible. It could also be demonstrated that the Bz-Arg group is superior to other used N-terminal protecting groups in CCK-8 syntheses, because it can be cleaved easily with trypsin.

This item appears in the following Collection(s)