The Serum and Glucocorticoid inducible Kinase in the regulation of sodium coupled amino acid transporters

Abstract

The Serum and Glucocorticoid inducible Kinase 1 (SGK1) is a protein kinase which regulates the function and expression of several ion channels and transporters. It was intially recognized as an immediate early gene whose mRNA level is increased in mammary tumour cell and fibroblast cell lines upon serum or glucocorticoids. The kinase is activated by phosphorylation in response to signals that stimulate phosphatidylinositol 3-kinase. The phosphorylation is mediated by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase1 (PDK1) and PDK2/H-motif kinase. Once phosphorylated, the kinase regulates its targets activity through phosphorylation at the SGK1 consensus site (Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr) or indirectly through inhibition of the ubiquitin ligase Nedd4-2. Nedd4-2 is an ubiquitin protein ligase that mediates binding of ubiquitin to its target proteins which tags them for degradation by the proteosome.

The sodium dependent excitatory amino acid transporter EAAT2 is a major glutamate carrier in the mammalian central nervous system. EAAT2 maintains the level of extracellular glutamate below the excitotoxic level. Defective expression of the transporter results in neuroexcitotoxicity that may contribute to neuronal disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS). SGK1 is expressed in the brain and interacts with the ubiquitin ligase Nedd4-2 to modulate membrane transporters and ion channels. The present study aimed to investigate whether SGK1 and its isoforms SGK2 and SGK3 as well as the related kinase, protein kinase B (PKB), regulate EAAT2.

To this end cRNA encoding EAAT2 alone or along with the kinases was expressed in Xenopus laevis oocytes and [3H] L-glutamate uptake was determined as a measure of EAAT2 activity. Funtional studies demonstrated that EAAT2 activity is stimulated by coexpression of SGK1, its isoforms SGK2 and SGK3 as well as PKB. Regulation of the closely related glutamate transporter EAAT1 was recently shown to involve SGK1-3. The effect of these kinases on EAAT1 is mediated, in part, by direct phosphorylation of EAAT1 at the SGK1 consensus site on the transporter and by interference with the downregulating effect of the ubiquitin ligase Nedd4-2. Since EAAT2 does not contain any SGK consensus site, we addressed whether the kinases modulate EAAT2 by impacting Nedd4-2 effects. In fact, the function of EAAT2 was diminished by Nedd4-2, an effect abrogated by additonal coexpression of SGK1. The kinase inhibits Nedd4-2 through phosphorylation without altering Nedd4-2 protein abundance as demonstrated by western blotting of whole cell lysates. Chemiluminescence assays revealed that stimulation of EAAT2 activity is caused by the enhancement of the transporter abundance in the cell surface. Enhanced EAAT2 abundance by SGK1 might represent a novel mechanism in the regulation of neuronal excitability. The exitatory amino acid transporter EAAT4 is predominantly expressed in Purkinje cells of cerebellar cortex. In those cells, EAAT4 keeps the level of extracellular glutamic acid in synaptic cleft below the toxic level. In a previous study EAAT4 abundance and function were shown to be modulated by SGK1 and Nedd4-2 but the precise mechanism of action remained illdefined. Expression studies in Xenopus oocytes demonstrated that EAAT4-mediated [3H] L-glutamate uptake and cell surface abundance are enhanced by coexpression of SGK1 and downregulated by coexpression of Nedd4-2. The present work aimed to identify the molecular mechanism of EAAT4 modulation by the kinase.

In contrast to EAAT2, EAAT4 sequence bears two putative SGK1 consensus sites at the amino and the carboxy terminus (Thr40 and Thr504) that are conserved among several species. To investigate the role of these putative SGK1 phosphorylation sites in EAAT4 modulation by SGK1, both sites were deleted and the mutated protein expressed alone or together with the kinase. Disruption of both SGK1 phosphorylation sites on EAAT4 (T40AT504AEAAT4) reduced the kinase effect on transporter function and plasma membrane expression. From both phosphorylation sites, Thr40 appears to be responsible for the stimulatory effect since T40AEAAT4 activity and abundance was not further modulated by the kinase. SGK1 may additionally modulate transport through inhibition of the ubiquitin ligase Nedd4-2 as observed with the EAAT2 transporter. Coexpression of SGK1 inhibits the downregulating effect of Nedd4-2 on EAAT4 and thus stimulates the expression of the transporter. The significance of Nedd4-2 in the downregulation of EAAT4 was demonstrated by silencing intrinsic (Xenopus) Nedd4-2. RNA interference-mediated silencing of endogenous Nedd4-2 (xNedd4-2) increased EAAT4 activity that was further stimulated upon additional SGK1 expression. In conclusion, the SGK1 kinase modulates EAAT4 activity through phosphorylation of the transporter at Thr40 and indirectly through inhibition of the ubiquitin ligase Nedd4-2. Hence SGK, through the regulation of EAAT2 and EAAT4 activity and expression might maintain proper neuronal excitability in the central nervous system.

Die Serum- und Glukokortikoid-induzierbare Kinase 1 (SGK1) ist eine Proteinkinase welche die Funktion und Expression verschiedener Ionenkanäle und Membrantransporter reguliert. Das Gen wird in Tumor- und Fibroblastenzellinien unter dem Einfluss von Serum und Glukokortikoiden aufreguliert. Die Kinase wird durch Phosphorylierung aktiviert durch Signale die weiter oberhalb in der Signalkaskade die PI3 -Kinase aktivieren. Die Phosporylierung erfolgt durch die Phosphoinositid-abhängige Kinasen 1 (PDK1) und PDK2. Bei Aktivierung phosphoryliert SGK1 ihre Ziele an einer spezifischen Konsensus-Stelle (Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr) oder indirekt durch die Inhibition der Ubiquitinligase Nedd4-2. Die Ubiquitinligase Nedd4-2 katalysiert ihrerseits die Anlagerung eins Ubiquitinrestes an ihre Ziele, die sie damit für die Degradation durch das Proteasom markiert.

Der natriumgekoppelte exzitatorische Aminosäuretransporter EAAT2 ist der wichtigste Glutamattransporter im zentralen Nervensystem der höheren Vertebraten. EAAT2 hält die extrazelluläre Konzentration des Glutamats unter toxischem Niveau. Eine gestörte Expression des Transporters führt zu Exzitotoxizität und trägt möglicherweise zu Krankheiten wie etwa der amyotrophischen lateralen Sklerose (ALS) bei. SGK1 ist im Gehirn exprimiert, interagiert dort mit der Ubiquitinligase Nedd4-2 und moduliert Membrantransporter und Ionekanäle. Die vorliegende Studie untersucht ob SGK1 und ihre Isoformen SGK2 und 3 sowie die Proteinkinase B (PKB) EAAT2 regulieren. Dazu wurde die cRNA des EAAT2 allein oder zusammen mit den jeweiligen Kinasen im Expressionssystem Xenopus laevis exprimiert und die [3H]-Glutamat Aufnahme als ein Maß für die EAAT2-Aktivität gemessen. Funktionelle Studien zeigten, dass die EAAT2-Aktivität durch Koexpression sowohl der SGK1 als auch ihrer Isoformen 2, 3 und PKB stimuliert wurde. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass diese Kinasen auch potente Regulatoren des EAAT1 sind. Dieser stimulierende Effekt auf die EAAT1-Aktivität wird durch eine direkte Phosphorylierung des Transporters an der SGK-Phosphorylierungsstelle und einer Interaktion mit der Ubiquitinligase Nedd4-2 verursacht. Da EAAT2 keine SGK1-Konsensusstelle enthält wurde untersucht, ob die Regulation des EAAT2 auf einer Interaktion mit der Ubiquitinligase Nedd4-2 beruht. In der Tat zeigte sich, dass der Transporter durch die Koexpression der Ligase Nedd4-2 inhibiert wird, ein Effekt der wiederum durch die Koexpression der SGK1 aufgehoben wird. Die Proteinkinase inhibiert die Ubiquitinligae Nedd4-2 durch ihre Phosphorylierung ohne, wie in Western Blots gezeigt, die Abundanz der Ligase zu verändern. Durch Chemilumineszenz konnte zudem gezeigt werden, dass die Stimulierung der EAAT2-Aktivität durch eine Erhöhung der Expresssion des Proteins an der Zelloberfläche verursacht wird. Die Erhöhung der EAAT2 Oberflächenexpression durch die Proteinkinase SGK ist möglicherweise ein neuer Mechanismus in der Regulation der neuronalen Erregbarkeit.

Der exzitatorische Aminosäuretransporter EAAT4 ist primär in den Purkin´je Zellen und im cerebralen Cortex exprimiert. In diesen Zellen bewirkt der Transporter niedrige Konzentrationen des Glutamats unter toxischem Niveau. In einer vorherigen Studie konnte gezeigt werden, dass EAAT4 Abundanz und Funktion durch SGK1 und Nedd4-2 moduliert werden, aber der grundlegende Mechanismus konnte dabei nicht aufgeklärt werden. Expressionsstudien in Xenopus Oocyten zeigten, dass die [3H]-L-Glutamataufnahme und -obeflächenexpression durch die SGK1 gesteigert und durch die Ubiquitinligase Nedd4-2 vermindert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den molekularen Mechanismus der EAAT4-Modulation durch die Kinase zu erklären. Im Gegensatz zum EAAT2 besitzt die Sequenz des EAAT4 zwei putative SGK1 Konsensus-Stellen am Amino- und Carboxy-Terminus (Thr40 und Thr504) die zwischen den verschiedenen Organismen stark konserviert sind. Um die potentielle Bedeutung dieser SGK Phosphorylierunsstellen in der EAAT4-Modulation durch die Proteinkinase aufzuklären wurden beide Stellen deletiert und das mutierte Protein allein oder zusammen mit der SGK1 exprimiert. Die Deletion beider SGK1 Phosphorylierungsstellen auf dem EAAT4-Protein (T40A, T504A) reduzierte den stimulierenden Effekt der Kinase auf die Funktion des Transporters und seine Oberflächenexpression. Von den beiden Phosphorylierungsstellen ist nur die erste (Thr40) für den stimulierenden Effekt verantwortlich da die T40AEAAT4 Aktivität und Abundanz nicht weiter durch die Proteinkinase moduliert wird. Die SGK1 hat möglicherweise, wie beim EAAT2 beschrieben, durch die Inhibition der Ubiquitinligase Nedd4-2 einen zusätzlichen Effekt auf EAAT4. Die Koexpression der SGK1 hebt den inhibierenden Effekt der Nedd4-2 auf und stimuliert dadurch die Expression des Transporters. Die Beteiligung der Ubiquitinligase Nedd4-2 an der Inhibition des EAAT4 konnte durch RNA-Interferenz nachgewiesen werden. Die durch RNA-Interferenz vermittelte Inhibition der endogenen Nedd4-2 (xNedd4-2)- aktiviert die EAAT4-Funktion welche weiterhin durch die zusätzliche Expression der SGK1 stimuliert wird. In der Zusammenfassung moduliert die SGK1-Kinase die Aktivität des EAAT4 durch die Phosphorylierung des Transporters am Thr40 und auf indirektem Wege durch die Inhibition der Ubiquitinligase Nedd4-2. Deshalb spielt die SGK1 Proteinkinase möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Homöostase der neuronalen Erregbarkeit im zentralen Nervensystem.