Identifikation und Katalogisierung retinal exprimierter Gene

Abstract

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Katalogisierung retinal exprimierter Gene. Dies sollte anhand dreier Teilprojekte verwirklicht werden. 1) Zunächst wurde ausgehend von isolierter mRNA aus WERI Rb1-Zellkulturen eine physikalische cDNA-Bank erstellt, deren Sequenzen als Grundlage für einen retinaspezifischen Expressionschip dienen sollten. Hierfür wurden initial 960 Klone präpariert und sequenziert. Es blieben 781 prinzipiell informative Klone übrig, von denen 466 Sequenzen nicht redundant vorlagen. Diese stellen grundsätzlich interessante Kandidatengene für bislang nicht klonierte erbliche Augenkrankheiten dar. Da jedoch keine gänzlich unbeschriebenen Sequenzen ermittelt werden konnten, wurde dieses Teilprojekt zugunsten einer in silico cDNA-Bibliothek des Auges aufgegeben. 2) Ein zweiter Ansatz sollte den Einfluss hypoxischer Bedingungen auf die Genexpression in WERI Rb1-Zellen untersuchen, da Sauerstoffmangel als Ursache oder begünstigender Faktor vieler Erkrankungen des menschlichen Auges wie AMD, des Glaukoms, oder diabetischer Retinopathie diskutiert wird. Als Vorversuch zur geplanten Globalanalyse durch Mikroarrays wurden die Expressionslevel von 18S-rRNA, GAPDH, EPO und VEGF unter normoxischen sowie hypoxischen Bedingungen nach 8, bzw. 24 Stunden Exposition verglichen. Während 18S-rRNA als Standard diente, sollte die Expression der anderen Gene unter Sauerstoffmangel signifikant durch den Hypoxe-induzierten Transkriptionsfaktor HIF-1 verstärkt werden. Entgegen den Erwartungen zeigte sich in den meisten Fällen aus unbekannten Gründen nur eine geringe Regulation. Signifikant waren lediglich eine Verringerung des Expressionslevels von GAPDH sowie von VEGF nach 24 Stunden unter Normbedingungen, weswegen eine Analyse auf der Basis eines Expressionschips verzichtet wurde. 3) Das dritte Teilprojekt bildete den Hauptteil der vorliegenden Arbeit: zur Analyse des Retinoms und Identifizierung möglicher Kandidatengene für erbliche Erkrankung der Netzhaut sollte eine vollständig annotierte in silico-Datenbank des menschlichen Auges erstellt werden. Hierfür wurden in zwei Ansätzen je knapp 200.000 ESTs aus der NCBI-Datenbank importiert und mittels des StackPACK-Programms geclustert. Zur Auswertung wurde lokal eine Annotationssoftware entwickelt, welche jede Sequenz aus der geclusterterten Stapeldatei einer Blast-Abfrage unterzog, aus der jeweiligen Blast-Resultatsliste den informativsten „best hit“ auswählte, ausgehend von diesem die Unigene- sowie die EntrezGene-Datenbanken des NCBI angesteuerte und schließlich ausgewählte Ergebnisinhalte in eine MySQL-Datenbank überführte. Hierbei wurde der erste Ansatz gegen die non redundant-Bibliothek geblastet, der zweite Ansatz gegen gegen die humane RefSeq-Datenbank. Nach dem Clustern wurden für den RefSeq-Anstz ca. 49.000 Blastresultate gezählt, von denen ca. 40.000 sowohl über einen Unigene- als auch einen EntrezGene-Eintrag verfügten. Bei der Analyse der Blast-Ergebnisse zeigte sich auch nach der Clusterung noch ein hohes Maß an Redundanz, da StackPACK Cluster in Subcluster aus sehr ähnlichen, aber nicht identischen Sequenzen (z.B. Isoformen) unterteilt. Hierbei lagen etwa 70% der im Auge exprimierten Transkripte mindestens doppelt vor. Die Eliminierung dieser Redundanzen erfolgte durch eine Filteroperation innerhalb der Datenbank („MySQL-Clustern“). Die ausgeblendeten Subcluster bleiben somit für eventuell nachfolgende Analysen erhalten. Insgesamt lagen ca. 11.500 nicht-redundante Sequenzen vor, die im menschlichen Auge exprimiert werden. Diese wiesen unterschiedliche Annotationsgrade auf. Exemplarisch für die Möglichkeiten der Datenbankanalyse wurde die chromosomale Verteilung der im menschlichen Auge exprimierten Gene untersucht. Für die Chromosomen 1-19 ergab sich eine relativ homogene Verteilung retinaler Gene zwischen 46-58%. Hierbei ist unklar, ob der Datensatz die tatsächlichen Verhältnisse im menschlichen Auge widerspiegelt. Abschließend erbrachte eine verknüpfte Abfrage anhand dreier bekannter Determinanten 29 Kandidatengene für einen möglichen weiteren Locus der Optikusatrophie Typ Kjer.

The objective of the present work was to identify and to catalogue retinal expressed genes. This was realized in three sub-projects. 1) Primary a physical cDNA-library was prepared using isolated mRNA from WERI Rb1-cell culture, whose sequences were planned to form the fundament for a retina-specific expression-chip. Therefor initially DNA from 960 clones were isolated and sequenced. 781 principally informative clones were left, of which 466 sequences were not redundant. They basically represent interesting candidate genes for inharitable eye diseases. Because no totally undescribed sequences could be acquired, this project part was relinquished in favor of an in silico cDNA-library of the human eye. 2) A second approach should analyze the influence of hypoxic conditions on gene expression in WERI Rb1-cells, because lack of oxygen is discussed as a cause or supporting factor for many diseases of the human eye like AMD, glaucoma or diabetic retinopathy. As a preliminary test to a projected global analysis by microarrays the expression levels of 18S-rRNA, GAPDH, EPO and VEGF were measured under normoxic as well as hypoxic conditions after 8, respectively 24 hours of exposition. Whereas 18S-rRNA served as a standard, the expression of the other genes should be upregulated significantly by the hypoxia-induced transcription factor HIF-1 under hypoxic conditions. Against expectations only a marginal regulation was detected for unknown reasons. Merely a decrease in the expression levels of GAPDH and VEGF were significant after 24 h under normoxic conditions. Due to this the microarray-experiments were cancelled. 3) The third sub-project was the main part of this thesis: to analyze the retinome and to identify putative candidate genes for hereditable diseases of the retina a fully annotated in silico-database should be established. Therefor in two approaches about 200.000 ESTs each were imported from the NCBI and were clustered by the StackPACK-program. To utilize the results a annotation-software was developed, which blasted every sequence from the clustered batch-file, chose the most informative „best hit“ from the blastresult-table, parse the Unigene-, respectively EntrezGene-databases and imported specific contents into a MySQL-database. The first approach was blasted against the non redundant-, the second one against the human RefSeq-library. After the clustering step some 49.000 blast-results were counted in the RefSeq-approach, some 40.000 of them had a Unigene as well as an EntrezGene entry. The analysis of the blast-results showed that after clustering there still was a high amount of redundancy, as StackPACK divides clusters into subclusters comprising of very similar, yet not identical sequences (e.g. isoforms). About 70% of the transcripts expressed in the human eye were counted at least twice. The elimination of these redundancies was done by changed filter options within the database („MySQL-clustering“). The subclusters which were faded out consequently remained for further investigations. Altogether about 11.500 non redundant sequences were left, which are expressed in the human eye. They showed different levels of annotation. As an example for the potential of data mining the genes expressed in the human eye were analyzed concerning their chromosomal distribution. There was a relatively homogenous distribution of retinal genes about 46-58% for chromomsomes 1-19. It is unclear if this dataset is representative for the real circumstances in the human eye. Finally a linked query by means of three known determinants delivered 29 candidate genes for a potential new locus of optical atrophy of the Kjer-type.