Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Assay-Technologien und Identifikation eines Ubiquitin-Liganden

Abstract

Die vorliegende Dissertation enthält drei sehr unterschiedliche Teilbereiche.

1. Assay-Technologie I: Zeitgleiches Mikroarray Die Entwicklung und Herstellung von Mikroarrays mit Strukturbreiten von 10 bis 12 µm und einer Spotdichte von 200.000 Compounds pro cm^2 wird ausführlich beschrieben. Trotz der hohen Dichte und Anzahl an Compounds lässt sich solch ein Mikroarray innerhalb von Minuten herstellen, anstatt wie konventionell in Tagen und Wochen. Dies liegt an der zeitgleichen Übertragung aller Compounds auf das Mikroarray, was zur Folge hat, dass die Größe des Mikroarrays nun keinerlei zeitlichen Limitationen unterliegt. Zudem ist die Dichte an Compounds pro cm^2 modernsten lithographisch hergestellten Mikroarrays gleichzusetzen, jedoch ohne einen entsprechenden Aufwand an Geräten. Die Mikroarrays wurden durch diverse Bindungsstudien validiert.

2.Assay Technologie II: Diffusionsplattform Bei der Diffusionsplattform handelt es sich um ein Device, der mit den gängigen 12-Well-Mikrotiterplatten kompatibel ist und der es erlaubt mit durch Diffusion einen 2D-Gradienten aus Wirkstoffen/Substanzen herzustellen. Dieser Konzentrationsgradient erstreckt sich für jede der beiden Substanzen über 3 bis 4 Größenordnungen. Somit ersetzt die Diffusionsplattform herkömmliche Techniken zur Evaluierung von Kombinationswirkstoffen und deren Konzentrationen, indem mit nur wenigen Pipettierschritten und ohne Verwendung von Automatisierungen gleiche oder bessere Ergebnisse und Messpunktdichten erreicht werden.

3. Identifizierung eines Ubiquitin-Liganden: In diesem mehr klassischen Teil wurden anhand von Kristallstrukturen Peptidsequenzen ermittelt, und synthetisiert, die potentiell mit Ubiquitin interagieren. Mittels 4 verschiedener Messmethoden (Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, Reflektometrischer Interferenz Spektroskopie, Isothermaler Kalorimetrie und 1H,15N-HSQC-NMR) konnte bei einem der ausgewählten Peptide eine Bindungkonstante von 10 bis 20 µM nachgewiesen werden. Diese Struktur kann eine Leitstruktur für die weitere Suche von Ubiquitin-Liganden darstellen.

This Ph.D. thesis contains three very different parts

1. Assaytechnology I: Time-parallel microarray The development and manufacturing of microarrays with structural features of 10 to 12 micron and to a Spotdichte of 200.000 compounds per squarecentimeter is described in detail. Never the less due to the high density and number of compounds such a microarray could be manufactured within minutes, instead of days and weeks like with conventional techniques. The time for this parallel transfer of compounds onto the microarray is independent from the number of compounds due to the time-parallel transfer. Besides the density of compounds per cm^2 of this new developed technique is adequate to most modern lithographically manufactured micro array, however without an appropriate expenditure of devices. The microarrays were validated by various binding studies.

2. Assaytechnology II: The diffusion device The diffusion device fits into an usual 12-Well-microtiterplate and permittes by diffusion a 2D-Gradienten of active compounds or substances. This concentration gradient extends for each of the two substances over 3 to 4 orders of magnitude. Thus the diffusion platform replaces conventional techniques for the evaluation of combination active substances and their concentrations-effect-studies in one run. With only few pipetting steps and without the use of automations same or better results and higher measuring point densities are reached.

3. Identification of a Ubiquitin ligand: In this more classical part on the basis of crystal structures peptide sequences were determined and synthesized, which potentially interact with Ubiquitin. With 4 physically independent analysis methods (fluorescence correlation spectroscopy, Reflektometri interference spectroscopy, Isothermaler calorimetry and 1H, 15N-HSQC-NMR) for one of the petides a binding constant of 10 to 20 µM could be obtained. This structur may be a lead for further developments.