Untersuchungen zur innaten und adaptiven Immunantwort von Labormäusen gegen Litomosoides sigmodonits (Nematoda, Filarioidea) : Vergleich der Genexpression in humanen Makrophagen nach Stimulation mit Filarien und anderen infektiösen Pathogenen

Abstract

Litomosoides sigmodontis gehört zu den Filarien, welche in Wirbeltieren parasitierende Nematoden sind, die in der Regel eine ausgeprägter Wirtsspezifität zeigen. Sie sind in der Lage das Immunsystem ihrer Wirte zu modulieren und dadurch der Immunabwehr des Wirtes entgehen zu treten. Genetische Unterschiede zwischen den Individuen einer möglichen Wirtspopulation scheinen dabei eine wichtige Rolle zu spielen. Verschiedene Mäusestämme reagieren unterschiedlich auf injizierte Mikrofilarien von Litomosoides sigmodontis. Per Definition suszeptible Stämme sind jene, die bis zu vier Wochen für die Eliminierung injizierter Mikrofilarien benötigen, wie BALB/b und BALB/c. Die resistenten C57BL/6 und B10.D2 eliminieren Mikrofilarien in bis zu 7 Tagen. Aus den Rückkreuzungen ergibt sich, dass diese Resistenz genetisch bedingt ist und von einem Gen vererbt wird, welches aufgrund verschiedener Allele für den unterschiedlich schnellen Abbau verantwortlich ist. Außerdem wurden erfolgreich Genotypisierungen mit Hilfe des D12Nds2-Marker durchgeführt. Dieser wurde zur Unterscheidung von resistenten und suszeptiblen Tieren der Kreuzung von BALB/c und DBA/1 2006 von Schumacher etabliert und definiert einen Bereich von 56 - 61 cM auf Chromosom 12 als Locus für den Mikrofilarämieresistenzlocus (mfr). Außerdem wurde der Einfluss unterschiedlicher MHC-Haplotypen auf die adaptive Phase der Immunantwort bei suszeptiblen Tieren untersucht. BALB/c und B10.D2 tragen den MHC-Haplotyp H-2d, BALB/b und C57BL/6 den MHC-Haplotyp H-2b. Der MHC-Haplotyp H2b der empfänglichen BALB/b verhält sich dominant gegenüber dem Haplotyp H2d der empfänglichen BALB/c, da alle F1-Nachkommen einer Kreuzung beider Stämme wie BALB/b bis zum Tag 15 mikrofilarienfrei waren. Stat4 spielt keine Rolle beim Abbau injizierter Mikrofilarien. Die Genotypisierung der Kreuzung von Stat4-k.o. mit homozygot resistenten Tieren zeigte, dass es Tiere gibt, die einen Stat4-Knockout tragen und heterozygote resistent sind. Diese Tiere waren auch phänotypisch resistent. Genexpressionsanalysen wurden an BALB/c mit Mikrofilarieninjektion und an BALB/c mit Weibchenimplantation durchgeführt. Durch eine Infektion mit diesen verschiedenen Stadien von L. sigmodontis werden Gene aus den funktionellen Bereichen Apoptose, Chemotaxis, Immunantwort, Inflammation, Proteintransport und- Lyse, Signaltransduktion, Transkription, Zelladhäsion, -proliferation und –zyklus heraufreguliert. Unter den herunterregulierten waren vor allem Anti-Apoptose-Gene. Genexpressionsanalysen an humanen Makrophagen nach Inkubation mit mehreren phylogenetisch weit voneinander entfernten Pathogenen (HCMV, CVB, Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus und L. sigmodontis) wurden durchgeführt, um globale Genexpressionsmuster zu finden, die mit der schnellen, unspezifischen Immunantwort gegen Pathogene assoziiert sind. Gemeinsam war den unterschiedlich stimulierten Makrophagen die Expression von IL-8 nach 2 und 8 Stunden. Nach 18 Stunden war IL-8 noch durch 3 Pathogenen differentiell exprimiert. Zu jedem Zeitpunkt waren Gene aus den funktionellen Bereichen Zellzyklus, -wachstum, Inflammation und Immunantwort, Tumor-Nekrose-Faktoren und Transkriptionsfaktoren exprimiert. Außerdem waren Gene differentiell reguliert, die mit Apoptose, Proteinfaltung und –lyse, Ionentransport, Zelladhäsion, Metabolismus, Signalkaskade, Endocytose und DNA-Replikation assoziiert sind.

Litomosoides sigmodontis is a filarial nematode which are in most cases largely host specific parasites of vertebrates. In order to evade the immune defence these parasites modulate their hosts immune system. Genetic differences between possible host individuals seem to play an important role. Different mousestrains show different microfilaraemia due to an injection of microfilariae of L. sigmodontis. We determined C57BL/6 and B10.D2 mice as resistant according to their ability to eliminate injected microfilariae within 7 days and BALB/b and BALB/c mice as susceptible while eliminating microfilariae within 4 weeks. According to different backcross generations this resistance ist genetically determined by one gene. It has different allels determing the durance of Elimination. In additional genotyping experiments with the D12Nds2-marker we confirmed this hypothesis. This marker was established to distinct resistant and susceptible mice in former experiments from Schumacher in 2006 and it defines the microfilaraemia resistance locus (mfr) on chromosome 12 distal of the centromere between 56 and 61 cM. Beside that we examined the influence of different MHC-haplotypes for the adaptive phase of the immune response in susceptible animals. BALB/c and B10.D2 have the MHC-haplotype H-2d, BALB/b and C57BL/6 have the MHC-haplotype H-2b. The MHC-haplotype H-2b is dominant relating to H-2d because of the uniform F1. Stat4 does not play a role in the elimination of injected microfilariae. Genotyping experiments with backcross generation of susceptible stat4 and homozygously resistant strains show that there are mice with a stat4-knockout and a resistance allel. In the additional parasitological experiments the resistance was not influenced by the knockout of stat4. Gene expression profiling was examined with BALB/c and an injection of microfilariae and with BALB/c with implanted female adult filariae and an additional injection of microfilariae. This infection leads to upregulated differentially expressed genes involved in apoptosis, chemotaxis, immune response, inflammation, protein transport and lysis, signal trannsduction, transcritption, cell -adhesion, -proliferation and –cycle. Anti-apoptosis was downregulated. Gene expression profiling with humane macrophages after incubation with several phylogentically very distinct pathogens (HCMV, CVB, Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus and L. sigmodontis) were examined to find global expression patterns related with the innate immune response. IL-8 was commonly expressed after 2 and 8 hours of incubation. IL-8 was exclusively expressed by 3 pathogens after 18 hours of incubation. We found differentially expressed genes involved in cell -cycle, growth, inflammation, immune response, tumor necrosis factors and transcription factors at every timepoint. Beside that we found genes associated with apoptosis, protein folding and lysis, ionic transport, cell adhesion, metabolism, signalcascade, endocytosis and DNA-replication.