Cdk2-Aktivität ist nicht essentiell für die Auslösung von Replikoninitiationen in Säugerzellen nach vorübergehender Hypoxie

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die schnelle Auslösung von Replikoninitiationen nach Reoxygenierung von hypoxisch inkubierten Zellen Cdk2-abhängig ist. Dabei wurde ein System benutzt, in dem die Säugerzellen ausgehungert und durch anschließenden Mediumwechsel wieder stimuliert wurden. Zellen, die direkt nach der Stimulation durch Mediumwechsel hypoxisch inkubiert werden, stauen sich in einem Zustand an, aus dem heraus es innerhalb von 1-2 Minuten nach Reoxygenierung zu einer schwallartigen Replikoninitiation kommt, die den Beginn einer synchronen S- Phase markiert. Die mit dem System erhaltenen Ergebnisse stützen folgende Aussagen: Cdk2 assoziiert 4-6 Stunden nach der Stimulation durch Mediumwechsel mit dem Chromatin, unabhängig davon, ob die Zellen danach normoxisch oder hypoxisch inkubiert wurden.

Inhibition der Cdk2, mit Olomoucin, Roscovitin, Staurosporin (100 nM), dem Cdk2/Cyclin Inhibitory Peptide II oder auch das Ausschalten der Cdk2 mit RNAi hatte keinen Einfluss auf den synchronen Schwall an Replikoninitiationen nach der Reoxygenierung.

Cdc6 und pRB, beides mögliche Ziele der Phosphorylierung durch die Cdk2, verhielten sich unterschiedlich: Cdk2-spezifische Inhibition verhinderte die Phosphorylierung von Cdc6 nach Reoxygenierung nicht. Chromatin-gebundenes pRB blieb noch über die Reoxygenierung hinaus hypophosphoryliert. Damit ist weder die Cdk2 Aktivität, noch die pRB Phosphorylierung für die Replikoninitiation nach Reoxygenierung notwendig. Die Phosphorylierung von Cdc6 nach Reoxygenierung und der anschließende Initiationsschwall konnten jedoch durch 10 mM Staurosporin gehemmt werden. In dieser Konzentration ist Staurosporin nicht mehr für Cdk2 spezifisch, sondern hemmt viele unterschiedliche Proteinkinasen. Dies deutet zum einen darauf hin, dass eine andere Kinase für die Phosphorylierung von Cdc6 verantwortlich sein muss und zum anderen das eine Phosphorylierung von Cdc6 möglicherweise essentiell für die letztendliche Auslösung der Replikoninitiation aus dem hypoxischen Präinitiationszustand heraus ist.

In this thesis it was examined whether the fast release of replicon initiation after oxygen recovery of hypoxically incubated cells depends on Cdk2.

Therefore a system was used where the cells were starved and stimulated through addition of fresh medium. Cells subjected to hypoxia after refeeding accumulated at a state in which they are ready to perform a burst of replicon initiations within 1-2 minutes after reoxygenation. This marks the synchronous beginning of the s-phase. Based on this system following statements could be concluded: Cdk2 associates within 4-6 hours after refeeding with the chromatin independent of hypoxic or normoxic incubation.

Inhibition of Cdk2 with olomoucine, roscovitine, staurosporine (100 nM) or the Cdk2/cyclin inhibitory peptide II had no influence of the synchronous burst of replicon initiation. Neither had a knock-down of Cdk2 by rnai.

Cdc6 and pRB, both possible targets of Cdk2 phosphorylation, behaved differentially. Cdk2 specific inhibition did not prevent phosphorylation of Cdc6 after reoxygenation, whilst chromatin-bound pRB remained hypophosphorylated beyond reoxygenation. Therefore neither the Cdk2-activity nor pRB phosphorylation are necessary for the repliconinitiation after reoxygenation.

The phosphorylation of Cdc6 after reoxygenation and the following burst of initiations could be prevented by treatment of the cells with 10 mM staurosporine. In this concentration however staurosporine is no more specific for Cdk2, but inhibits a wide variety of kinases. This points at another kinase which must be responsible for the phosphorylation of Cdc6 and that a phosphorylation of Cdc6 is possibly essential for triggering the initiation after transient hypoxia.