Einsatz synthetischer Affinitätsverbindungen zur Analyse der MHC Klasse II-assoziierten Antigenprozessierung

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Affinitätsverbindungen zur Detektion und Inhibition aktiver Proteasen zu synthetisieren, um diese Werkzeuge zur Beantwortung zellbiologisch-immunologischer Fragestellungen im Bereich der MHC Klasse II-assoziierten Antigen-prozessierung einzusetzen. Das biotinylierte E-64-Analogon DCG-0N wurde synthetisiert, und sein Einsatz zur Darstellung, Isolierung und Identifizierung von Cysteinproteasen nach Markierung in Zelllysaten und endozytischen Zellfraktionen mit anschließender Auftrennung mittels 1D und 2D-SDS-PAGE charakterisiert und etabliert. Analog ermöglichte die Verwen-dung des AEBSF-Analogons BAEBSF die Darstellung aktiver Serinproteasen in Zelllinien und primären APC. Dendritische Zellen (DC) stellen die funktionell entscheidende Zellpopulation zur Initiierung einer MHC Klasse II-vermittelten zellulären Immunantwort dar. Mit den synthetisierten Affinitätsverbindungen konnte hier erstmals gezeigt werden, dass sowohl bakterielle als auch virale Infektionen (Yersinia enterocolitica und HCMV) das Aktivitätsmuster MHC Klasse II-assoziierter Proteasen in humanen DC sowie die Prozessierung von Modellantigenen in vitro verändern. Insbesondere die HCMV-Infektion bewirkt dabei eine deutliche Reduktion der Aktivität der beiden Schlüsselproteasen des MHC Klasse II-Systems, Cat S und AEP, was die Effizienz der Antigenprozessierung vermindert und damit zu dem durch eine HCMV-Infektion hervorgerufenen Defekt der zellulären Immunität in vivo beitragen könnte. Ebenso konnte gezeigt werden, dass Autophagie die Expression, Aktivität und Funktion endozy-tischer Proteasen in APC moduliert. Um die Prozessierung von Antigenen oder Autoantigenen in DC verstehen, modulieren, oder gar vorhersagen zu können, muss die Sequenz bekannt sein, in der exogene Antigene nach der Internalisierung durch DC mit den verschiedenen Proteasen der Antigenprozessierung interagieren. In einem wesentlichen Teil dieser Arbeit wird daher erstmals die Interaktion von internalisiertem Material mit dem MHC Klasse II-assoziierten proteolytischen System in intakten humanen DC charakterisiert. Dazu wurden DC mit löslichen Affinitätsverbindungen inkubiert, welche dann mittels verschiedener Endozytosewege aufgenommen werden und an aktive Proteasen binden. Es zeigte sich, dass so internalisiertes Material selektiv und nahezu ausschließlich mit aktivem Cat S interagiert, was die Modellvorstellung unterstützt, dass Cat S die vorherrschende Papain-ähnliche Cysteinprotease für die initiale Prozessierung von exogenem Antigen in humanen DC darstellt. In LPS-aktivierten DC wurde dabei aktives Cat S von internalisiertem Material eher erreicht als in ruhenden DC, wahrscheinlich aufgrund einer vermehrten Aktivierung von Cat S schon in frühen Endosomen wegen des durch die LPS-Aktivierung hervorgerufenen pH-Abfalls im endozytischen Kompartiment von DC. Interessanterweise aktivieren LPS-stimulierte DC jedoch gleichzeitig einen gegenläu-figen Regulationsmechanismus, indem sie neu synthetisiertes Cat S im endozytischen Kom-partiment innerhalb kurzer Zeit vollständig degradieren, wie hier erstmals gezeigt wird. Die Resultate der vorliegenden Arbeit demonstrieren ferner, dass der Transport von Peptid-ähnlichen Substanzen zu aktivem Cat S in intakten humanen DC durch Kopplung an ein größeres Protein oder an zellpenetrierende Peptide (CPP) erheblich verbessert werden kann. Dabei bleibt der selektive Transport zu einem Cat S-enthaltenden Kompartiment erhalten, wenn die Aufnahme mittels Makropinozytose durch die Kopplung der Affinitätsverbindung an ein größeres Protein erleichtert wurde. Durch Kopplung eines CPP an DCG-0N (PS457) wurden dagegen alle endozytischen Cysteinproteasen in unselektiver Weise erreicht, dies jedoch mit erheblich höherer Effizienz. Der bis heute diskutierte Mechanismus der Internali-sierung von CPP konnte durch die Verwendung von PS457 ebenfalls beleuchtet werden. Sie erfolgt sowohl energieabhängig mittels Endozytose als auch energieunabhängig und führt zunächst zu einer Anreicherung im endozytischen Kompartiment und nicht, wie meist angenommen, zu einem unselektiven energieunabhängigen Transit der Zellmembran mit Anreicherung im Zytosol. Der hocheffiziente Transport von CPP in ein Cat S-enthaltendes Kompartiment von DC könnte genutzt werden, um durch die Kopplung antigener Peptide an CPP die Effizienz der Peptidbeladung von MHC Klasse II bei Vakzinierungs-Strategien zu verbessern. Da neben früheren Arbeiten auch die hier gewonnenen Ergebnisse eine zentrale Rolle von Cat S für die MHC Klasse II-assoziierte Antigenprozessierung implizierten, wurde der Cat S-selektive Inhibitor LHVS synthetisiert und sein Einsatz zur Manipulation MHC Klasse II-assoziierter Autoimmunerkrankungen im Mausmodell der Multiplen Sklerose in vivo getestet. In diesem Pilotexperiment ließ sich der Ausbruch der Erkrankung tatsächlich durch den systemischen Einsatz des Cat S-Inhibitors günstig beeinflussen. Zusammenfassend wurden Affinitätsverbindungem zur Detektion von Proteasenaktivität synthetisiert und zur Analyse MHC Klasse II-assoziierter Proteasen in APC eingesetzt. Dabei konnte nicht nur erstmals direkt die Modulation des proteolytischen Systems in APC durch HCMV und Yersinien demonstriert, sondern auch ein selektiver Transport von exogenem Antigen zu Cat S in humanen DC identifiziert, charakterisiert und moduliert werden. Dies impliziert u.a. Cat S als ein Schlüsselenzym der Prozessierung von Autoantigenen bei MHC Klasse II-assoziierten Autoimmunerkrankungen, und der hier erstmals gezeigte günstige Effekt einer Cat S-Inhibition auf den klinischen Verlauf der Multiplen Sklerose im Mausmodell sollte weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet stimulieren.

The aim of this work was the synthesis of affinity molecules that allow both detection and inhibition of active proteases, as well as the application of these probes to answer cell-biological and immunological questions in the field of MHC class II-associated antigen processing. The biotinylated E-64 analogue DCG-0N was synthesized. Its use to monitor, isolate and identify cysteine proteases after labelling in cell lysates und endocytic fractions, followed by separation via 1D and 2D-SDS-PAGE, was characterized and established. BAEBSF, an AEBSF-analogue similarly allowed the visualisation of active serine proteases in cell lines and primary APC. Dendritic cells (DC) represent the functionally crucial cell population for the initiation of the MHC class II-mediated cellular immune response. The affinity molecules synthesized allowed to show that both bacterial and viral pathogens (Yersinia enterocolitica and HCMV) manipulate activity patterns of MHC class II-associated proteases in human DC as well as the processing of model antigens in vitro. Especially infection with HCMV causes a significant reduction in activity of both key proteases of the MHC class II-system, Cat S and AEP, leading to a diminished efficiency of antigen processing that might contribute to the defect of cellular immunity that is observed during HCMV infection in vivo. In addition, we show that autophagy modulates expression, activity and function of endocytic proteases in APC. Understanding the rendez-vous between exogenous antigens after their internalisation by DC with the various proteases involved in antigen processing might help to modulate or even predict the processing of antigens or auto antigens in DC. A considerable part of this work therefore characterizes the interaction of internalized material with the proteolytic system in viable human DC. To this end DC were incubated with soluble affinity molecules, which then are internalized via different mechanisms of endocytosis and finally bind to active proteases. These experiments showed that internalized material selectively and almost exclusively interacts with active Cat S, supporting the model that Cat S is the dominant papain-like cysteine protease for initial processing of exogenous antigen in DC. In LPS-activated DC, internalised material was reached earlier by Cat S compared to resting DC, probably due to an increased activation of Cat S already in early endosomes, in agreement with the decrease in local pH caused by LPS-activation. Interestingly enough, LPS-stimulated DC activate an inverse mechanism of regulation by degrading newly synthesized Cat S in the endocytic compartment within a short period of time, as demonstrated here. In addition, the results of this work demonstrate that transport of peptide-like substances to active Cat S in viable human DC can be considerably improved via attachment to a larger protein or to a cell-penetrating peptide (CPP). Thus the selective transport to a Cat S-containing compartment is maintained when internalisation is improved via macropinocytosis by coupling of the affinity molecule to a protein. Attachment of a CPP to DCG-0N (PS457) led to a considerably increased efficiency in detection of active cathepsins, while selectivity of transport was lost, so that the entire set of endocytic cysteine proteases was reached in a nonselective fashion. The use of PS457 also shed light on the mechanism of uptake of CPP, which is still under debate. Internalization of CPP is in part energy-dependent and endocytosis-mediated, but partly energy-independent. It leads to an initial enrichment in the endocytic compartment and is therefore not simply the result of passive transit of the cell membrane followed by an accumulation in the cytosol. The highly efficient transport of CPP to a Cat S-containing compartment in DC may be used to improve the loading of exogenous peptide loading to MHC class II, e.g. in experimental vaccination strategies. Because the results obtained corroborated a major role of Cat S for MHC class II-associated antigen processing, we synthesized the Cat S-selective inhibitor LHVS. This compound was then tested with respect to the manipulation of autoimmunity in the MHC class II-associated disease multiple sclerosis, using a mouse model in vivo. Pilot experiments showed that the onset of the disease was significantly delayed due to the systemic application of the Cat S-inhibitor. In summary, affinity molecules were synthesized to detect protease activity and to analyse MHC class II-associated proteases in APC. This not only allowed us to identify the manipulation of the proteolytic system in APC by HCMV and Yersinia, but also to demonstrate a selective transport of exogenous antigen to Cat S in human DC. The favourable effect of Cat S-inhibition on the clinical course of multiple sclerosis in a murine model corroborates a key role of CatS in MHC II-associated autoimmunity and should stimulate further experiments in this field.