Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese der Aminocoumarin-Antibiotika Clorobiocin und Coumermycin A1

Abstract

Die Aminocoumarin-Antibiotika Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1 werden von verschiedenen Streptomycetenarten gebildet und sind Hemmstoffe der bakteriellen DNA-Gyrase. Ihre therapeutische Anwendung blieb jedoch durch ihre schlechte Wasserlöslichkeit, die geringe Aktivität gegenüber gram-negativen Bakterien und ihre relativ hohe Toxizität in Eukaryonten eingeschränkt. Für die Gewinnung neuer strukturell modifizierter Aminocoumarin-Antibiotika durch genetische Manipulation benötigt man genaue Informationen über die Biosynthese dieser Antibiotika. Die Biosynthesegencluster dieser drei Antibiotika sind bereits kloniert, sequenziert und die Funktion vieler Gene aufgeklärt. Dennoch bedarf es immer noch weiteren gezielten Untersuchungen, um die Biosynthese vollständig zu verstehen. Clorobiocin enthält einen Pyrrol-2-carboxylteil, der über eine Esterbindung mit dem Desoxyzucker verbunden ist. Dieser Pyrrolteil ist wichtig für die Bindung des Antibiotikums an sein biologisches Target. Die Gene, die an der Biosynthese dieser 5-Methylpyrrol-2-carbonsäure-Einheit beteiligt sind sowie die für die Übertragung der Acylkomponente auf den Desoxyzucker und dessen Modifizierung verantwortlich sind, konnten bereits durch Geninaktivierung, Expression und biochemische Untersuchungen identifiziert werden. Dabei handelt es sich um cloN2, cloN3, cloN4, cloN5 und cloN6. Im Cluster von Clorobiocin treten aber noch zwei weitere Gene cloN1 und cloN7 auf, die zu dieser Gengruppe gehören. Ein Ziel dieser Arbeit war die Funktion dieser beiden Gene durch Geninaktivierung aufzuklären. Beide Mutationen resultierten in der Akkumulation der gleichen Sekundärmetabolite: Novclobiocin 104 und Pyrrol-2-carbonsäure. Dieses Ergebnis zeigte, dass CloN1 und CloN7 zusammen mit CloN2 für den Transfer des Pyrrol-2-carboxylteils von dem Acylcarrierprotein CloN5 auf den Desoxyzucker des Clorobiocins verantwortlich sind. Clorobiocin, Novobiocin und Coumermycin A1 enthalten als gemeinsames Strukturelement einen ungewöhnlichen Desoxyzucker mit einer 5,5-Dimethylstruktur. Die Biosynthese dieses Desoxyzuckers beinhaltet eine C-Methylierungsreaktion, die in anderen Desoxyzucker-Biosynthesewegen noch nicht beschrieben worden ist. Deshalb war eine weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit diesen Methylierungsschritt näher zu charakterisieren. Die Inaktivierung des putativen C-Methyltransferasegens cloU im Clorobiocin-Cluster führte zu einem Verlust der axialen Methylgruppe an Position 5 des Desoxyzuckers. Somit konnte die Funktion von cloU als C-Methyltransferase nachgewiesen werden. Gleichzeitig beweist es aber auch, das die Biosynthese des Desoxyzuckerteils von Clorobiocin über eine 3,5-Epimerisierung des dTDP-4-Keto-6-Desoxyglucose-Intermediats verläuft. Die cloU-Defektmutante akkumulierte die Aminocoumarine jedoch vorwiegend in Form der Aglyka und nur geringe Mengen in Form der Glykoside. So war eine weitere Aufgabe, die Ursache für diese geringe Glykosylierungseffizienz zu finden. Eine heterologe Expression von einem Teil des Elloramycin-Biosynthesegenclustern in der cloU-Defektmutante zeigte, dass die Synthese der dTDP-L-Rhamnose der limitierende Faktor für die Aminocoumarin-glykosidbildung war, und nicht wie vorher erwartet der Glykosyltransfer. Um nun diese Limitation zu beheben, wurden Genkonstrukte, die verschiedene Desoxyzucker-biosynthesegene enthielten, in die cloU-Defektmutante eingebracht. Das Plasmid pRHAM, welches die Gene oleL, oleS, oleE und oleU vom Oleandomycin-Cluster enthält und zusammen dTDP-L-Rhamnose bilden, führte zu einer 26-fachen Produktionssteigerung der glykosylierten Aminocoumarine. Eine Expression der 4-Ketoreduktase OleU alleine resultierte mit einer 8-fachen Steigerung. Diese Ergebnisse zeigten, dass die 4-Ketoreduktase CloS eine hohe Spezifität für C-5-methylierte Intermediate aufweist. Des weiteren konnten die drei neuen Antibiotika Vanillobiocin, Isovanillobiocin und Declovanillobiocin aus dem Kulturmedium einer cloQ-Defektmutante von S. roseochromogenes DS12.976, die in der Biosynthese der prenylierten 4-Hydroxybenzoesäure des Clorobiocins blockiert ist, isoliert werden. Spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass die isolierten Verbindungen eine ähnliche Struktur wie Clorobiocin aufwiesen. Jedoch enthielten die neuen Verbindungen anstelle der prenylierten 4-Hydroxybenzoesäure die Vanillinsäure als Acylkomponente. Außerdem wurde die Bildung der zentralen Pyrroleinheit, der 3-Methylpyrrol-2,4-dicarbonsäure, von Coumermycin A1 untersucht. Inaktivierung der Gene couR1-couR4 im Coumermycin A1-Produzenten S. rishiriensis führte zu Mutanten, die kein Coumermycin A1 mehr produzierten. Jedoch konnte durch anschließende Fütterung der Mutanten mit 3,5-Dimethylpyrrol-2,4-dicarbonsäure keine Wiederherstellung der Coumermycin A1-Produktion erzielt werden. Somit konnte die genaue Funktion der Gene couR1-couR4 noch nicht nachgewiesen werden.

The aminocoumarin antibiotics novobiocin, clorobiocin and coumermycin A1 are produced by various Streptomyces strains and are inhibitors of the bacterial DNA-gyrase. Their therapeutic application has been limited, however, by the poor water solubility, low activity against gram-negative bacteria and toxicity in eukaryotes. More information on the biosynthesis is required to develop new, structurally modified aminocoumarin antibiotics by genetic manipulation. The biosynthetic gene clusters of these three antibiotics have already been cloned, sequenced and the function of most of the genes have been elucidated previously. Nevertheless, more investigation is necessary to understand their biosynthesis completely. Clorobiocin and coumermycin A1 contain 5-methylpyrrole-2-carboxyl moieties, attached to a deoxysugar via an ester bond. Correspondingly, seven genes clo/couN1 to clo/couN7 are located in the gene clusters of clorobiocin and coumermycin A1, but not in the cluster of novobiocin. By gene inactivation experiments and biochemical investigations, it has been proven that the genes cloN2, cloN3, cloN4, cloN5 and cloN6 are involved in the biosynthesis of the 5-methylpyrrole unit and its transfer to the deoxysugar as well as its modification. However, the function of cloN1 and cloN7 in the clorobiocin cluster remained to be investigated. The aim of this work was the clarification of the function of these two genes by gene inactivation experiments. Both mutations resulted in the accumulation of the same secondary metabolites: novclobiocin 104 and pyrrole-2-carboxylic acid. The results proved that CloN1 and CloN7 - in addition to CloN2 - are required for the transfer of the pyrrole-2-carboxyl moiety from the acyl carrier protein CloN5 to the deoxysugar moiety of clorobiocin. Clorobiocin, novobiocin and coumermycin A1 contain an unusual branched 5,5-gem-dimethyl deoxysugar with as a common structural element. The biosynthesis of this deoxysugar includes a C-methylation reaction which has not yet been described in other deoxysugar biosynthesis. Therefore a further aim of this work was a more detailed investigation of this methylation step. The inactivation of the putative C-methyltransferase gene cloU in the clorobiocin biosynthetic gene cluster led to the loss of the axial methyl group at C-5 of the deoxysugar moiety of clorobiocin. This proved that the function of the cloU gene product is a C-methyltransferase in the biosynthesis of this antibiotic. At the same time it proves that the biosynthesis of the deoxysugar moiety of clorobiocin proceeds via a 3,5-epimerization of the dTDP-4-keto-6-deoxyglucose intermediate. Aminocoumarins accumulated in cloU-defective mutants predominantly in the aglyca form and only small amounts in the glycoside form. Investigation on the reason of the low glycosylation effiency in the mutant was a further aim of the project. Heterologous expression of a partial elloramycin biosynthetic gene cluster indicated that the rate of dTDP-L-rhamnose synthesis, rather than the rate of glycosyl transfer, was limiting for glycoside formation in this strain. To circumvent this limitation, gene constructs containing various deoxysugar biosynthesis genes were introduced into the cloU-defective mutant. Introduction of the the plasmid pRHAM containing the genes oleL, oleS, oleE and oleU the biosynthesis of dTDP-L-rhamnose from the oleandomycin biosynthetic gene cluster led to a 26-fold increase of the production of glycosylated aminocoumarins. Expression of the 4-ketoreductase OleU alone resulted in an 8-fold increase. These results indicated that the 4-ketoreductase CloS is quite specific for the 5-C-methylated intermediate. In addition, three new antibiotics, vanillobiocin, isovanillobiocin and declovanillobiocin, could be isolated from the culture broth of a cloQ-defective mutant of the clorobiocin producer S. roseochromogenes DS12.976 which is blocked in the biosynthesis of the prenylated 4-hydroxybenzoic acid moiety of clorobiocin. Spectroscopic analysis showed that the isolated compounds are structurally similar to clorobiocin but contain vanillic acid as the acyl component instead of the prenylated 4-hydroxybenzoic acid present in clorobiocin. Furthermore the formation of the central pyrrole unit, the 3-methylpyrrole-2,4-dicarboxylic acid, of coumermycin A1 was investigated. Inactivation of the genes couR1-couR4 in the coumermycin A1 producer S. rishiriensis led to mutants which do not produce coumermycin A1. However, the coumermycin A1 production could not be regenerated by supplementing the mutant with 3,5-dimethylpyrrole-2,4-dicarboxylic acid. Consequently, the exact function of the couR1-couR4 genes could not yet be demonstrated.