Activity spectrum, in vivo efficacy of albomycin and its use in characterization of hydroxamate iron transport in Streptococcus pneumoniae

Abstract

Albomycin overproduction was standardized and mid-scale fermentation was carried out. From the fermentation broth albomycin was recovered to homogeneity by three-step chromatography. This purified albomycin was used throughout this study. The activity spectrum of albomycin against common bacterial pathogens was determined. Correlation of ferrichrome utilization and albomycin sensitivity was verified. Intrinsic albomycin resistance of Proteus and Morganella attributed to the lack of a ferrichrome transport system, unlike other enterobacteriaceae tested. Pseudomonads and Haemophilus related generas were also intrinsically resistant. Among gram positives, coagulase positive staphylococci, Bacillus subtilis and pneumococci were highly sensitive to albomycin. Reasons of pneumococcal sensitivity to albomycin and salmycin were determined. Competitive cross-feeding of sideromycins with hydroxamate siderophores and proteolytic cleavage experiments provided evidence that albomycin is transported in pneumococci through a hydroxamate transport system. Targeted mutagenesis ( by Insertion and Deletion) were done to identify the involvement of the putative iron transport systems in the R6 strain. This approach identified the gene for the FhuD binding protein of the transport system. Complementation by ectopic insertion confirmed the role of fhuD in hydroxamate transport in pneumococcus. To identify the other components of the hydroxamate transport machinery, an in vitro random mutagenesis method was standardized. From a randomly mutagenized library transport negative mutants were picked. From these mutants the fhuB and the fhuG genes were identified. Recombinant FhuD was cloned and overexpressed. This FhuD is a lipoprotein that is able to bind a wide variety of hydroxamate substrates but not free Fe2+/3+ or haemin. Substrate binding leads to conformational changes conferring partial resistance to proteolytic attack. A 3D homology model of Sp-FhuD was made based on E. coli FhuD crystal structure. 3D alignment identified both similarity and minor variations at the substrate binding pocket. Other than in vitro, efficacy of albomycin was tested in a murine infection model. After 6 h of single dose antibiotic administration, albomycin performed better than equivalent dose of gentamycin to reduce bacterial load in Y. enterocolitica infected mice spleen. Albomycin was highly effective against murine pneumococcal infections. All albomycin treated mice recovered from pneumococcal infection. In a mixed infection model albomycin resistant mutants showed a compromised virulence.

In dieser Arbeit wurde die Überproduktion von Albomycin standardisiert und eine Fermentation im mittleren Maßstab durchgeführt. Das Albomycin wurde über dreistufige Chromatographie aus dem Kulturfiltrat gewonnen und aufgereinigt. Das auf diese Weise gereinigte Albomycin wurde für diese Studie verwendet. Desweiteren wurde das Tätigkeitsspektrum von Albomycin gegen allgemeine bakterielle Krankheitserreger festgestellt. Eine Korrelation von Ferrichromaufnahme und damit einhergehender Albomycinempfindlichkeit wurde überprüft. Die vorhandene Albomycinresistenz von Proteus und Morganella, wurde anders als bei den übrigen geprüften Enterobacteriaceae, auf das Fehlen eines Ferrichromtransportsystem zurückgeführt. Pseudomonaden und Haemophilus-Arten zeigten dagegen eine intrinsische Resistenz. Unter Grampositiven waren Koagulase-positive Staphylokokken, Bacillus subtilis und Pneumococci in hohem Grade empfindlich gegenüber Albomycin. Die Gründe für die Empfindlichkeit der Pneumokokken gegenüber Albomycin und Salmycin wurden näher untersucht. Versuche zur kompetitiven Verdrängung von Hydroxamtasiderophoren durch Sideromycine, sowie proteolytische Spaltung von Albomycin lieferten Beweis, daß Albomycin von Pneumokokken über das Hydroxamattransportsystem aufgenommen wird. Im Stamm Streptococcus pneumoniae R6 wurde eine zielgerichtete Mutagenese (Insertion und anschliessende Deletion) durchgeführt, um die für die Albomycinaufnahme verantwortlichen, mutmaßlichen Eisentransportsysteme zu kennzeichnen. Hier konnte gezeigt werden, daß das Gen FhuD eine Schlüsselrolle im Transport einnimmt. Die Komplementierung des entsprechenden Gens bestätigte die Rolle von fhuD für den Hydroxamattransport bei Pneumokokken. Um die übrigen Komponenten des Hydroxamattransportsystems zu identifizieren, wurde eine randomisierte in vitro- Mutagenese durchgeführt. Aus der erhaltenen DNA-Bibliothek wurden entsprechende Mutanten gepickt und die Gene fhuB und fhuG identifiziert. Zudem wurde ein rekombinantes FhuD kloniert und überexprimiert. FhuD ist ein Lipoprotein mit der Fähigkeit, eine Reihe von Hydroxamte als Substrat, jedoch kein freies Eisen oder Häm, zu binden. Die Substratbindung hat eine Konformationsänderung zur Folge, die zu einer teilweisen Resistenz gegen einen proteolytischen Verdau führt. Aufgrund von Daten aus der Kristallstruktur des homologen FhuD von E.coli, wurde 3D-Modell für das FhuD von S. pneumoniae entwickelt. Ein 3D-Alignment konnte sowohl Ähnlichkeiten als auch kleiner Variationen im Bereich der Substratbindestelle identifizieren. In einem weiteren Teil wurde die in vivo-Aktivität von Albomycin am Maus-Infektionsmodell untersucht. In mit Yersinia enterocolitica infizierten Mäusen, zeigte sich Albomycin als Einzeldosis nach sechs Stunden wirksamer als eine äquivalente Dosis Gentamycin hinsichtlich der Reduzierung der Bakterienzahl. Albomycn erwies sich im Maus-Modell außerdem als hocheffektiv gegenüber Infektionen mit S. pneumoniae. Hier erholten sich alle mit Albomycin behandelten Mäuse von der Pneumokokken-Infektion. Im gemischten Infektionsmodell zeigten Albomycin-resistente Stämme eine abgeschwächte Virulenz.