Aquaglyceroporins of Trypanosoma brucei a potential target for chemotherapy: cloning, heterologous expression, biochemical characterization and localization

Abstract

The protozoan parasite Trypanosoma brucei undergoes a complex life cycle including two dividing stages, i.e. the long slender form in blood, lymphatic fluid, and cerebrospinal fluid of its mammalian host and the procyclic form in the midgut of the tsetse fly. The bloodstream forms depend on glycolysis for ATP production, with glycerol as an alternative substrate (Bakker et al., 1997; Michels et al., 2000). Glycolysis in trypanosomes differs markedly from the corresponding pathway in higher eukaryotes. Most strikingly, the first seven glycolytic reactions occur in a peroxisome-like organelle called glycosome (Opperdoes and Borst, 1977). The Lactate dehydrogenase enzyme is absent and, therefore, the glycerol kinase reverse activity is fundamental for the survival of the parasite in low oxygen pressure. Under anaerobic conditions, glucose is converted to equimolar amounts of glycerol and pyruvate, which are both secreted from the parasite to ensure the essential continuity of glycolysis activity. On the other hand, the procyclic form possesses a functional Krebs cycle and oxidative phosphorylation capabilities, using amino acid as energy source. Procyclic form is subjected to considerable variations of osmolarity, as this parasite stage lives in the fly's midgut where the conditions vary depending mainly on feed of the insect. In all these situations the ability of the parasite to cope with sudden gradients change of glycerol and water must be important for its survival and therefore, specialized systems as aquaglyceroporins must be present in this parasite. It was suggested previously that glycerol transport in T. brucei occurs via specific membrane proteins (Wille et al., 1998). Here, we describe cloning and biochemical characterization of the three trypanosomal aquaglyceroporins (AQP; TbAQP1–3), which show a 40–45% identity to mammalian AQP3 and AQP9. AQPs belong to the major intrinsic protein family and represent channels for small non-ionic molecules. Both TbAQP1 and TbAQP3 contain two highly conserved NPA motifs within the pore-forming region, whereas TbAQP2 contains NSA and NPS motifs instead, which are only occasionally found in AQPs. For functional characterization, all three proteins were heterologously expressed in yeast and Xenopus oocytes. In the yeast fps1Delta mutant, TbAQPs suppressed hypoosmosensitivity and rendered cells to a hyper-osmosensitive phenotype, as expected for unregulated glycerol channels. Under iso- and hyperosmotic conditions, these cells constitutively released glycerol, consistent with a glycerol efflux function of TbAQP proteins. TbAQP expression in Xenopus oocytes increased permeability for water, glycerol, dihydroxyacetone and urea, in a minor grade. TbAQPs were virtually impermeable for other polyols; only TbAQP3 transported appreciable erythritol and ribitol. Thus, TbAQPs represent mainly water/glycerol/dihydroxyacetone channels involved in osmoregulation and glycerol metabolism in T. brucei. The expression of TbAQPs transcripts and their coded proteins throughout the live cycle of the parasite was confirmed by using Northern blot and respective antibodies directed specifically against each channels. On the other hand, the localization of these channels was dissimilar. TbAQP1 was localised almost exclusively at the parasite's flagellum in both bloodstream and procyclic form. This channel possesses a long N-terminus totally different and especially longer than that of their isoforms. This characteristic along with the information published in the literature (Nasser and Landfear, 2004), indicate that the N-terminus contains the signal peptide to target this protein to the flagellum. TbAQP2 and 3 targets principally to plasma membrane in bloodstream form parasites. It was also demonstrated that TbAQPs are promising targets to design new strategies to control the parasite. TbAQPs can be used mainly as an importing system for toxic metabolites. DHA, which is highly transported by these channels, shows an important toxic effect on the parasite, represented by an IC50 of 1.03± 0.14 mM. As judged by FACS and electron microscopy experiments, the principal DHA effect was an arrest in G2/M in the cell cycle of the parasite. AsIII, SbIII and methylglyoxal also permeate the channels and killed the parasite in nM to µM range, with an IC50 of 0.308, 0.103, and 21 µM, respectively. Although these compounds are known to be toxic for human beings, the observed IC50 values were in the range of therapeutic use or below the known concentrations to cause relevant cytotoxic effects.

Der Parasit Trypanosoma brucei unterliegt einem komplizierten Entwicklungszyklus. Er besitzt zwei vermehrungsfähige Formen: nämlich die long slender Blutform, die sich im Blut, im Lymphgefäßsystem und im Liquor cerebrospinalis des Säugetierwirts befindet, und die prozykliche Form, die im Mitteldarm des Insektenvektors vorkommt. Die Blutform hängt zur ATP-Herstellung vollständig von der Glycolyse ab und kann Glycerol als alternative Energiequelle nutzen. Die Glycolyse ist in Trypanosoma im Vergleich zu den höheren Eukaryonten unterschiedlich organisiert. Dabei ist die auffallenste Besonderheit, dass die sieben ersten Reaktionen in einem Organell, dem so genannten Glycosom (einem modifizierten Peroxysom) ablaufen (Opperdoes and Borst, 1977). Da Trypanosomen keine Lactat Dehydrogenase besitzen, ist die Aktivität der Glycerinkinase (insbesondere im Fall einer limitierten Sauerstoff-Versorgung) von besonderer Bedeutung für das Überleben des Parasiten. Während unter aeroben Bedingungen Glucose stöchiometrisch zu Pyruvat umgesetzt wird, entstehen unter anaeroben Bedingungen äquimolare Konzentrationen an Glycerin und Pyruvat, um die Energieversorgung durch die Glycolyse sicher zu stellen. Die prozyklische Form besitzt dagegen einen funktionellen Citratzyklus und die oxydative Phosphorylierung, wobei insbesondere Aminosäuren (Prolin) als Energiequelle benutzen werden können. Beim Transfer der Blutform durch die Niere, besonders aber auch für die procyclische Form im Mitteldarm, unterliegen die Parasiten beträchtlichen Schwankungen in der Osmolarität. In all diesen Fällen ist die Fähigkeit der Trypanosomen Glycerin und Wasser effizient zu transportieren von essentieller Bedeutung. Dabei sind die Aquaglyceroporine, die eine hocheffiziente und selektive Wasser/Glycerin-Transportrate vermitteln, von zentraler Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit ging es um die Klonierung und Charakterisierung der drei Aquaglyceroporine (TbAQP1–3) von Trypanosoma brucei, wobei ihre Lokalisierung und die potenzielle Nutzung als Wirkstoff-Angriffspunkte im Vordergrund standen. TbAQP1-3 zeigen eine 40-45%ige Identität zu den menschlichen AQP3 and AQP9. TbAQP1 und 3 besitzen die beiden klassischen NPA-Motive, während TbAQP2 einige Abweichungen von der klassischen AQP-Sequenz enthält: die NPA-Motive sind durch ein NSA- und ein NPS-Motiv ersetzt, außerdem steht ein Leucin-Rest nach dem zweiten Motiv anstelle des hoch konservierten Arginin-Restes. Die funktionelle Charakterisierung wurde in zwei heterologen Expressionssystemen durchgeführt, in Hefe und Oocyten aus Xenopus laevis. TbAQP1-3 haben sich dabei wie unregulierte Glycerin-Transporter verhalten, wenn sie in der Hefe-Mutante fps1Delta, die keine Glycerin-Kanäle besitzt, exprimiert wurden. Unter hypo-osmotische Bedingungen wurde die typische Empfindlichkeit dieser Hefe-Mutante durch TbAQP1-3 supprimiert, während die transformierten Zellen unter iso- und hyper-osmotischen Bedingungen Glycerin konstitutiv sezernierten. Durch die Expression von TbAQP1-3 in Xenopus Oocyten wurde bestätigt, dass diese Kanäle Glycerin, Wasser und Dihydroxyacetone mit hoher Leistung transportieren. Im Gegensatz dazu wurde eine eher geringe Fähigkeit zum Harnstoff-Transport gefunden. TbAQP1-3 zeigten praktisch keine Transportkapazität für andere Polyole, nur TbAQP3 ließ merkliche Mengen von Erythritol and Ribitol passieren. Deshalb stellen TbAQP1-3 hauptsächlich Wasser/Glycerin/Dihydroxyaceton-Kanäle dar, die für die Regulation der Osmolarität und des Glycerol-Stoffwechsel von Trypanosoma brucei von entscheidender Bedeutung sind. Durch Northern blot Analyse, sowie durch Verwendung spezifischer Antikörper im Western blot wurde gezeigt, dass TbAQP1-3 unterschiedlich exprimiert und reguliert werden. Ebenso war die Lokalisierung den Kanälen unterschiedlich. TbAQP1 ist in der Blutform sowie in der prozyklichen Form fast ausschließlich im Flagellum lokalisiert. Dieser Kanal besitzt im Vergleich zu TbAQP2 und TbAQP3 einen längeren N-Terminus, der nach Vergleich mit Literaturdaten (Nasser and Landfear, 2004) als Signal-Peptid dienen könnte. TbAQP2 und 3 wurden dagegen hauptsächlich in der Plasmamembran der Blutform gefunden. Schließlich wurden experimentelle Daten ermittelt, nach denen TbAQP1-3 vielversprechende targets für die Wirkstoffentwicklung sein könnten, wenn die TbAQP1-3 als Aufnahmesysteme für potenzielle Medikamente benutzt werden. DHA, das von TbAQP1-3 sehr gut transportiert wird, zeigte eine hohe Toxizität auf den Parasiten (IC50 = 1,03 ± 0,14 mM), wobei der hauptsächliche Effekt ein Zellzyklus-Arrest in der M/G2 Phase war. In der Ratte liegen die LD50-Werte dagegen im molaren Bereich und in der Kosmetik-industrie wird DHA komplikationslos eingesetzt. AsIII, SbIII und Methylglyoxal passieren ebenfalls die Pore aller drei TbAQPs und induzierten den Zelltod im nano- bis mikromolaren Bereich, wobei IC50-Werte von 31 nM, 10 nM bzw. 21 µM auftreten. Obwohl entsprechende chemischen Verbindungen eine erhebliche Toxizität für den Menschen besitzen, waren die beobachteten IC50-Werte in einem tolerablen Bereich, da Antimon-Verbindungen z.B. bei Leukämie in ähnlicher Konzentration eingesetzt werden.