Massenspektrometrische Untersuchungen von modifizierten Nucleosiden und ihre Evaluierung als Tumormarker bei Brustkrebs

DSpace Repository


Dateien:

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-23915
http://hdl.handle.net/10900/48941
Dokumentart: Dissertation
Date: 2006
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Laufer, Stefan
Day of Oral Examination: 2006-07-12
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Nucleoside , Brustkrebs , Harn , Massenspektrometrie , HPLC
Other Keywords:
modified nucleosides , breast cancer , urine , mass spectrometry , HPLC
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

Die Identifizierung von Substanzen als Tumormarker für Krebserkrankungen steht seit langem im Fokus der Forschung. Viele der etablierten Tumormarker in der klinischen Praxis sind jedoch nicht spezifisch und/oder sensitiv genug und korrelieren nur bei einem Bruchteil der untersuchten Fälle mit der Erkrankung. Andere Marker sind zur Überwachung einer Therapie geeignet, nicht aber für die Diagnose. Insbesondere bei Brustkrebs ist die Diagnose in frühen Stadien schwierig. Modifizierte Nucleoside sind Endprodukte des RNA-Metabolismus und werden aufgrund des gestörten Stoffwechsels bei Tumorerkrankungen in erhöhten Konzentrationen im Urin ausgeschieden, wie in vielen Studien und bei verschiedenen Krebserkrankungen beobachtet wurde. Modifizierte Nucleoside könnten daher eine Alternative zu den etablierten Tumormarkern bieten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden modifizierte und unmodifizierte Nucleoside aus Proben biogenen Ursprungs mit Hilfe von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken charakterisiert und identifiziert. Für die Trennung der Nucleoside wurde eine HPLC-Methode entwickelt, um die erhaltenen Fraktionen mittels MALDI-TOF-MS und nano-ESI-MS auf bisher unbekannte Nucleoside und sonstige Ribosylderivate zu untersuchen. Die hohe Massengenauigkeit der entwickelten MALDI-TOF-Methode ermöglicht die Berechnung einer Summenformel, wobei durch Datenbanksuche acht Ribosylderivate identifiziert werden konnten. Anschließend wurde eine auto-LC-MS3-Methode mit Ionenfallen-Detektion entwickelt, die auf Informationen zur Struktur von unbekannten Komponenten abzielt. In Urinproben von Brustkrebspatientinnen wurden 38 Ribosylderivate nachgewiesen, von denen 16 in vorhergehenden Arbeiten identifiziert wurden. Sechs weitere wurden im Rahmen dieser Arbeit identifiziert, teilweise durch Vergleich der Retentionszeit und Fragmentierung mit Standardsubstanzen, teilweise durch Vergleich der Fragmentierung mit der des Nucleinbasen-Standards. Für 11 weitere Substanzen konnten aufgrund der Fragmentierung und der Summenformel Strukturvorschläge gemacht werden. Mit der entwickelten auto-LC-MS3-Methode wurden neben den Urinproben Zellkulturüberstände und Mikrosomeninkubationen untersucht. Die Zellkulturüberstände von MCF7-Brustkrebs-Zelllinien wurden mit denen von gesunden MCF10A Brustepithelzellen verglichen. Schließlich wurden die neu identifizierten neben den bekannten Nucleosiden und sonstigen unbekannten Ribosylderivaten auf ihr Potenzial als Tumormarker untersucht. Dazu wurde eine Klassifizierungsstudie unter Einsatz von Methoden der Bioinformatik zur Unterscheidung von Brustkrebspatientinnen und gesunden Probandinnen auf Basis der Konzentrationsverhältnisse der Ribosylderivate im Urin durchgeführt.

Abstract:

The identification of compounds that may be used as tumour markers has been in the focus of research for several years. Most of the established tumour markers show either a low sensitivity or specificity and are elevated significantly in only a few of the investigated cases. Other markers are suitable for surveying therapy, but not for cancer diagnosis. Especially in case of breast cancer, the diagnosis in an early state is difficult. Modified nucleosides are end products of RNA metabolism and are excreted in cancer patients' urine in higher concentrations. This was observed in several studies and different types of cancer. Modified nucleosides could therefore be an alternative as tumour markers. In this work, modified and normal nucleosides from biological fluids were characterized and identified using different mass spectrometric methods. These methods were applied for analysing urine samples and cell culture supernatants. For semi-preparative separation of the nucleosides, an HPLC method was developed. The fractions were examined using MALDI-TOF-MS and nano-ESI-MS. A MALDI-TOF-MS-method was developed for measuring with high mass accuracy. Based on the accurate mass, a sum formula may be calculated and a data base search performed. With this method, eight unknown compounds in urine could be identified. Furthermore, an auto-LC-MS3-method with an Ion Trap mass spectrometer was developed for structural information on unknown compounds. With this method, 38 ribosyl derivatives could be detected in urine samples of breast cancer patients. 16 of these nucleosides had been identified before; six were identified by comparison of retention time and fragmentation with standard compounds. For further 11 compounds, structure proposals were made based on the fragmentation and sum formula. The auto-LC-MS3-method was also applied on cell culture supernatants and microsomal incubations. Supernatants of MCF7 breast cancer cells were compared to those of MCF10A epithelial cells. Finally, all identified nucleosides and further potential ribosyl derivatives were examined for their potential as tumour markers. For classification of urine samples of breast cancer patients and healthy volunteers based on the relative concentrations of 32 compounds, a support vector machine algorithm was applied.

This item appears in the following Collection(s)