Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die Entwicklung des cerebralen Cortex

Abstract

In dieser Arbeit wurde eine Microarray-Expressionsanalyse mit dem Ziel durchgeführt, neue Gene mit regionalisierter Expression im cerebralen Cortex der Maus zu finden. Die auf diese Weise gefundenen Gene wurden annotiert und mittels in-situ-Hybridisierung verifiziert. Neben bekannten Genen wurden 26 neue ESTs gefunden, von denen 5 in dieser Arbeit ausführlicher dargestellt wurden. Diese konnten als neue Markergene für die Cortexentwicklung identifiziert werden. In dem Wettstreit der beiden Theorien um die Cortexspezifizierung, dem Protocortex-Modell auf der einen Seite, welches die "Fernprogrammierung" des Cortex durch einwachsende thalamische Afferenzen annimmt, und dem Protomap-Modell auf der anderen Seite, welches intrinsische Faktoren vorzieht, konnten in dieser Arbeit weitere 2 Gene gefunden werden, die bereits eine intrinsische Identifizierung zulassen. Die Gene ERM (Etv5) und TRIM46 zeigten Expression in ihren speziellen corticalen Arealen bereits vor dem Eintreffen thalamo-corticaler Projektionen zum Stadium E14 und behielten diese bis zum Abschluss der embryonalen Cortexentwicklung bei bzw. weiteten diese darüber hinaus aus. Das Gen TRIM46 wurde für eine detailliertere Analyse ausgewählt, weil es einer bekannten Proteinfamilie angehört, von deren Vertretern viele an Krankheiten auch im Menschen beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Knock-out-Maus von TRIM46 angefertigt und die Tiere vom embryonalen Stadium E9 an bis zu einem adulten Alter von 10 Monaten hinsichtlich eines Phänotyps untersucht. Das Gen zeigte neben dem Gehirn aber auch Expression im Endothel von wachsenden Arterien und anderen Endothelien in der Lunge, der Niere, der Harnblase, dem Darm, dem Innenohr, dem Auge. Hier konnten Abnormitäten in den Tieren festgestellt werden, allerdings mit relativ geringen Penetranzen von einigen Prozent der Geborenen. Es zeigten sich Blutungen mit Entzündungen in der Lunge. Auffälliger waren die Ausbildungen von Tumoren in mehreren der Tiere.

Die Microarray-Expressionsanalyse in dieser Arbeit hatte den Fokus auf das Entwicklungsstadium E18,5, zu dem allgemein die primäre Cortexentwicklung gerade abgeschlossen ist. Erwartungsgemäß dürften hier weniger solche Gene zu finden sein, bei deren Ausfall sich große morphologische Veränderungen, etwa Fehlen corticaler Strukturen, abzeichneten. Dies wäre eher für Gene zu erwarten, die aus einer Expressionsanalyse von früheren Stadien wie E16 und E14. Die in der Expressionsanalyse zum Stadium E18,5 gefundenen Gene sollten eher eine Funktion in dem Feinbau oder der funktionalen Reifung des Cortex haben.

Zusätzlich wurde in dieser Arbeit ein Yeast-Two-Hybrid-Screen durchgeführt, um Protein-Interaktionspartner für das Gen TRIM46 zu finden, die weitere Hinweise auf dessen Funktion auf molekularer Ebene bringen sollten. Leider sind viele der dabei festgestellten Proteine genauso unbekannt wie das TRIM46, so dass sie zwar Hinweise auf neue Regulationssysteme in Zellen geben, jedoch keine weiteren Anhaltspunkte über deren Funktion. Es fanden sich aber auch einige bekannte Proteine als Partner wie das Ferritin oder Fhl2. In den Veröffentlichungen von vielen der Interaktionspartner tauchen Zusammenhänge mit Epilepsie, Alzheimer-Erkrankung und Tumoren gehäuft auf. In der Diskussion wurde eine Hypothese für die denkbare tumorsuppressive Wirkung von TRIM46 durch seine Regulation von Ferritin im Zusammenhang des für die Angiogenese bedeutsamen HIF-Regulationsweges aufgestellt, die Gegenstand weiterer Überprüfung wäre. Neben dem Ferritin wurde auch Eg1 als Tumorangiogenese-Marker in der Literatur beschrieben und hier mit dem Yeast-Two-Hybrid-Ansatz gefunden, ebenso der Faktor Usp33/VDU1 als bekannter Interaktionspartner des HIF-Weges, wodurch sich die Hinweise verdichten. Diskutierte Hypothesen über mögliche Auswirkungen eines TRIM46-KO gehen über mehrere Stufen und somit indirekte Wirkungen, was wiederum Raum für kompensatorische Mechanismen gibt. Auf der anderen Seite können solche indirekten und über mehrere Stufen und Partner vermittelten Fernwirkungen ein neuer Ansatz zur Erklärung von gerade komplizierten, chronischen oder nur mit geringer Penetranz auftretenden Phänotypen und Krankheiten sein, die die Wissenschaft heute eben wegen dieser Komplexität bisher nicht erklären bzw. auf ihre eigentlichen Ursachen zurückführen kann. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ansätze wären folglich für zukünftige Forschungen wertvoll in der Erwartung, sie in den Kontext weiterer Fortschritte auch auf anderen mit ihnen zusammenhängenden Gebieten stellen zu können und so schließlich den Gesamtzusammenhang nach und nach zu erarbeiten. Die hier dargestellte Arbeit wäre dann ein erster Schritt in eine solche Richtung.

Identification of New Genes in Cerebral Cortex Development. This research includes developing a large DNA microarray screen that produces raw data. The data are then statistically analyzed to produce a set of cluster data. These cluster data are used to predict new genes. The predictions have been successfully confirmed using methods and experiments such as in-situ hybridizations, yeast-two-hybrid-screening, assays in cell culture, and creation of a mouse knock out.

Several new genes with regionalized expression in cortical areas have been predicted and further confirmed by in-situ hybridization. One of these genes, a new kind of ubiquitine ligases, was choosen for a mouse knock out that was analysed in more detail. The phenotype of the knock out successfully displayed alterations in vascular stability. These results support a recent finding of common pathways between vascular and nervous systems development published in Nature Reviews Genetics, September 2003, p. 710-720, by Peter Carmeliet. It further displayed a certain incidence of tumorigenesis and a hypothesis was drawn to implement the new gene in the angiogenesis pathway.