Monocytic cell responses to Aspergillus fumigatus: investigation of phagocytosis, gene expression and peptide presentation

Abstract

Aspergillus fumigatus is a filamentous fungi found in the environment. It is pathogenic to humans, causing life-threatening infections in immunocompromised patients. Spores (conidia) of A. fumigatus enter the lungs by inhalation. They are able to settle down, germinate to hyphae. Monocytes play a critical role in defense against A. fumigatus, as soon as conidia of the fungus enter the blood stream and spread out into the body. Monocytes are then recruited to the infection site where they attack and phagocytose these conidia. We therefore analyzed the interaction of A. fumigatus conidia and hyphae with human monocytes on different levels. First, we investigated phagocytosis of live conidia by peripheral blood monocytes after 3 and 6 hours and found the majority to phagocytose up to 3 conidia during the first 3 hours. We further investigated gene expression in monocytes after incubation with conidia and hyphae for 3, 6 and 9 hours, using real-time RT-PCR and microarray analyses. We found inactivated hyphae to induce strong cytokine and chemokine expression already after 3 hours and conidia first after 6 and 9 hours. Genes like pentraxin-3 (PTX3), which was shown to facilitate phagocytosis of conidia, was up-regulated after 3 hours. Interestingly, Toll-like receptors like TLR2 and TLR4 were not regulated at all. We finally found urokinase-type plasminogen activator (uPA) and the monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1, CCL2) to be potential key regulators involved in A. fumigatus-induced tissue damage and inflammation, as obtained by a pathway-generating software. In a second effort to get more detailed data from the A. fumigatus-monocytic interaction, we analyzed peptides presented on HLA-I and -II molecules of a monocytic cell line (THP-1) after 6-hour-incubation with inactivated hyphae. For this purpose, we isolated HLA-peptides by immunoprecipitation using specific antibodies and analyzed them by ESI-Q-Tof mass spectrometry. Unfortunately, only human peptides were found on class II. Class I peptides were previously modified at their N-termini by different isotopes in order to differentiate peptides isolated from the stimulated cells from peptides of the non-stimulated ones. As on class II, no A. fumigatus peptides could be detected on class I, only human.

Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitär vorkommender, opportunistisch humanpathogener Schimmelpilz, der bei immunsupprimierten Patienten schwere Krankheitsbilder hervorrufen kann. Durch Inhalation gelangen die Pilzsporen (Konidien) in die Lunge, wo sie auskeimen können. Monozyten spielen in der Kontrolle der Immunabwehr gegen Aspergillus fumigatus eine wichtige Rolle, sobald Sporen des Pilzes in die Blutbahn eindringen und sich so im Körper verteilen. Monozyten werden dann zur Infektionsstelle rekrutiert um dort den Pilz zu bekämpfen. Wir haben deshalb die Interaktion von A. fumigatus Konidien und Hyphen mit humanen Monozyten auf verschiedenen Ebenen analysiert. Zuerst wurde die Phagozytose von lebenden Konidien nach 3 und 6 Stunden untersucht. Die Mehrheit der Monozyten konnte bis zu 3 Konidien während den ersten 3 Stunden phagozytieren. Weiterhin untersuchten wir die Genexpression in Monozyten nach Inkubation mit Konidien und Hyphen für 3, 6 und 9 Stunden, mittels real-time RT-PCR und Mikroarray Analysen. Wir fanden dass inaktivierte Hyphen eine starke Induktion der Zytokin- und Chemokinexpression bereits nach 3 Stunden verursachen können, Konidien erst nach 6 und 9 Stunden. Gene, die bei der Erkennung und Phagozytose von Konidien eine Rolle spielen, wie Pentraxin-3 (PTX3), waren bereits nach 3 Stunden hochreguliert. Interessanterweise, Toll-like Rezeptoren wie TLR2 und TLR4 waren gar nicht reguliert. Als letztes fanden wir dass die Interaktion zwischen urokinase-type plasminogen activator (uPA) und monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1, CCL2) möglicherweise eine essentielle Rolle bei der A. fumigatus-induzierten Lungen- und Gewebeverletzung spielen könnte. Um mehr Informationen und Daten über die A. fumigatus-Monozyten Interaktion zu bekommen, untersuchten wir die Peptidpräsentation auf HLA-I und -II Molekülen in einer monozytären Zelllinie (THP-1), nach 6 Stunden Inkubation mit A. fumigatus Hyphen. Dazu isolierten wir die HLA-Peptide mittels Immunoprezipitätion mit spezifischen Antikörpern und analysierten diese mit ESI-Q-Tof Massenspektrometrie. Es konnten leider nur humane HLA-II-Peptide gefunden werden. Mit Hilfe einer stabilen Isotopenmarkierung der HLA-I Peptide konnte eine differentielle Analyse durchgeführt werden, um die von den stimulierten mit denen von den unstimulierten Zellen zu unterscheiden. Es konnten jedoch ebenso keine A. fumigatus Peptide gefunden werden, nur humane.