Nickel-NTA-Multichelatoren auf Oberflächen im Mikroarrayformat sowie Peptidmikroarrays durch native chemische Ligation

Abstract

Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Untersuchung von Wechselwirkungen niedermolekularer Verbindungen auf Oberflächen durch fluoreszenzmikroskopische Methoden. Ziel war es dabei, spezifische Methoden für die Anbindung von Molekülen auf Oberflächen zu untersuchen. Dabei stand die Verwendung von Mikroarrays im Vordergrund, um mehrere Wechselwirkungen möglichst parallel betrachten zu können. Zur Lösung der Fragestellung wurden zwei Methoden gewählt, die unterschiedliche Anbindungsmethoden an die Oberfläche erlauben. Zum einen wurde erstmals die native chemische Ligation auf Oberflächen angewandt, die eine sehr chemoselektive, kovalente Anbindung von Proteinen und Peptiden über ein N-terminales Cystein erlaubt. Zum anderen wurde die bekannte, selektive, koordinative und reversible Bindung zwischen Oligohistidinen und Ni2+-NTA-Komplexen angewendet. Beide Methoden erwiesen sich als robust und konnten erfolgreich für die selektive Anbindung unterschiedlicher Moleküle im Mikroarrayformat etabliert werden. Für die koordinative Bindung wurde gezeigt, dass Unterschiede in der Selektivität bei gleichem Bindungsmotiv (Oligohistidin) existierten, falls die Länge des Oligohistidins variiert wurde. Um ein Maß für die Stabilität der Bindung der Oligohistidine an die Ni2+-Multichelatoren zu erhalten, wurden die Oligohistidine durch Titration mit dem Kompetitor Imidazol von den Chelator-Spots abgelöst. Längere Oligohistidine waren wesentlich stabiler auf den Oberflächen immobilisiert als kurzkettige, und benötigten zur Ablösung von der Oberfläche höhere Konzentrationen an Imidazol. Die Stabilitätsunterschiede bei der Anbindung zwischen langkettigen und kurzkettigen Oligohistidinen wurden durch den Einsatz von Multichelatoren noch vergrößert. Interessanterweise wurde der Stabilitätsunterschied bei gleichzeitiger Inkubation von kurzkettigem Hexahistidin und langkettigem Dekahistidin noch deutlicher. Somit war die Selektivität der Anbindung eines Oligohistidins abhängig von der Anwesenheit des anderen Oligohistidins. Die Untersuchung der Oligohistidin-NTA-Wechselwirkung mit Hilfe von simulierten molekulardynamischen Methoden (molecular modeling) zeigte, dass keine energetisch stark begünstigten Konformationen bestimmter Koordinationen existieren. Dies wurde durch experimentelle Ergebnisse von Kooperationspartnern bestätigt. Die chemoselektive, gerichtete, kovalente Anbindung über die native chemische Ligation stellt eine sehr spezifische Immobilisierungsmethode dar. Die als Positiv- und Negativkontrollen eingesetzten Peptide zeigten durch ihre Anbindung und Nichtanbindung an die Oberfläche Übereinstimmung mit dem Bindungsmechanismus der nativen chemischen Ligation. Es konnten nur Peptide an die Oberfläche anbinden, die über ein N-terminales Cystein verfügten. Die Immobilisierungsmethode war kompatibel für Anwendungen im Bereich von Proteinmikroarrays, da spezifisch angebundene Proteine auf definierte Art immobilisiert sind, und ihre räumliche Orientierung damit festgelegt ist. Die physiologisch relevanten Eigenschaften des auf diesen Oberflächen getesteten Proteins blieben erhalten was durch die selektive Erkennung eines Phosphopeptides durch die intakte SH2-Domäne eines immobilisierten SHP-2C-Proteins nachgewiesen werden konnte. Die bereits etablierte Methode zur Beschichtung von Mikrocantilever Arrays mit Cystein-Peptiden konnte durch den Einsatz eines Nanopipettier-Roboters weiter verbessert werden. Einzelne Cantilever eines Mikrocantilever Arrays ließen sich mit Hilfe des Nanopipettier-Roboters selektiv mit einem antikörperbindenden Cystein-Peptid beschichten. Durch Immunfluoreszenzfärbung konnte gezeigt werden, dass die durch den Roboter mit Peptidlösung getroffenen Cantilever scharfkantig beschichtet waren, und das Peptid stabil immobilisiert war. Referenzcantilever mussten bei dieser Methode nicht nachträglich erzeugt werden.

In this thesis, interactions of low molecular weight compounds on surfaces using fluorescent microscopy were studied. The objective of this study was to apply different immobilization techniques for the attachment of specific molecules to the surface. The work focused on the application of microarrays to study a variety of protein interactions in parallel. To address the problem of specific immobilization, two different immobilization techniques were chosen. For the first time, the application of the native chemical ligation on surfaces was established, allowing a chemoselective covalent linkage of proteins and peptides via their N-terminal cysteine residues. Additionally, a selective, coordinative and reversible binding of oligohistidines and Ni2+-complexes was used to link proteins to artificial surfaces. Both methods proved to be reliable and robust and have successfully been applied to the immobilization of different molecules in the microarray format. Depending on the length of the oligohistidine, differences in the coordinative binding of the same binding motif (oligohistidines) were demonstrated. To test the stability of the oligohistidine binding to Ni2+-multichelators, immobilized oligohistidines on chelator spots were titrated with the competitor Imidazole. Longer oligohistidines showed a higher affinity to the surface molecules than shorter ones and higher concentrations of the Imidazole compound was needed for the replacement of the oligohistidines from the spots. The differences in the surface affinity of shorter or longer oligohistidines were increased by the application of multichelators. Interestingly, the differences in the stability between short chained hexahistidines and long chained decahistidines increased when both histidines were simultaneously spotted on the arrays. Thus, the selective binding of one oligohistidine appears to depend on the presence of the other oligohistidine. Molecular modelling revealed that the interaction of oligohistidines with NTA does not depend on an energetically privileged coordination between histidines and their chelators, as it was confirmed by experimental results with cooperative partners (His14 for example has a higher affinity than His10). The chemoselective, directed, covalent attachment via native chemical ligation has shown to be a very specific and reproducible immobilization technique. Binding and non-binding of the respective control peptides was equivalent to the binding characteristics of the native chemical ligation. Only peptides containing an N-terminal cysteine were able to bind to the surface. Thus, the chemical ligation technique can be applied to the area of protein microarrays, since the spatial orientation of the proteins is fixed and a specifically directed attachment is easily achievable. Relevant physiological properties such as surface conformation of the tested proteins, can be maintained as it was demonstrated by selective recognition of a phosphopeptide via the intact SH2-domain of an immobilized SHP-2C protein. The formerly established method of coating microcantilever arrays with cysteine-peptides was substantially improved by applying a nanopipetting device. This device allowed single cantilevers of a microcantilever array to be selectively coated with an antibody binding cysteine-peptide. Immunofluorescent staining demonstrated that cantilevers hit with the peptide solution by the nanopipetting device were coated in a sharp-edged fashion and the peptide was immobilized on the surface in a stable manner. Moreover, the latter introduction of reference cantilevers was unnecessary.