Das lysosomale Kompartiment als Ansatzpunkt für therapeutische Anwendungen

Abstract

In dieser Arbeit konnte in zwei unterschiedlichen Systemen die Rolle des Lysosoms bzw. der Vakuole als Ansatzpunkt für therapeutische Anwendungen gezeigt werden. In den Studien zu Candida albicans konnte gezeigt werden, dass die Pilz-Vakuole und ihre Funktion einen Einfluss auf die Virulenz von Candida albicans haben. Um das zu prüfen, wurden zehn Gene ausgewählt, deren Funktion in Saccharomyces cerevisiae bekannt ist. Ihre Sequenzen wurde im C. albicans-Genom identifiziert. Die Gene wurden in C. albicans deletiert und die entstandenen Null-Mutanten auf ihre Morphologie hin untersucht. Die Integrität der Hyphen wurde durch Induktion des Yeast-to-Hyphae-Übergangs analysiert. Alle Stämme wurden im Mausmodell für systemische Candidosis auf ihre Virulenz getestet. Die Deletion von Genen, die für die Erhaltung der vakuolären Integrität wichtig sind, beeinflusst die Vakuolenmorphologie, den Yeast-to-Hyphae-Übergang und die Virulenz im Maus¬modell für systemische Candidosis. Die Minderung der Virulenz korreliert mit dem Grad der Vakuolenfragmentierung und -funktion. Die Deletion der Rab-GTPase CaYPT7 führte zu einer starken Fragmentierung des vakuolären Kompartiments, einer signifikant verkürzten Hyphenlänge und einer drastisch reduzierten Virulenz. Diese Arbeit belegt, dass die Vakuolenbiogenese und ihre Funktion direkt in die Virulenz des Pilzes Candida albicans involviert sind. Das macht dieses Zellkompartiment zu einem Ansatzpunkt für antifungale Therapien. In den Studien zu Tumorzellen konnte gezeigt werden, dass die Autophagie und ihre Funktion einen Einfluss auf die Strahlenreaktion humaner Tumorzelllinien haben. Um das zu prüfen, wurden sechs Gene ausgewählt, die in die Bildung des Autophagosoms involviert sind. Ihre Expression wurde spezifisch mittels siRNAs gehemmt. Die Hemmung der Genexpression wurde auf RNA- und Proteinebene hin untersucht. Die Fähigkeit transfizierter Zellen zur Autophagosomenbildung nach Bestrahlung wurde elektronenmikroskopisch und fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Die Beeinflussung des klonogenen Überlebens transfizierter Tumorzellen nach Bestrahlung wurde im Koloniebildungstest geprüft. Die Geninhibition mittels siRNA führte zu einer stabilen Expressionshemmung. Die Hem¬mung von Genen, die für die Ausbildung der Autophagosomen wichtig sind, beeinflusste qualitativ und quantitativ die zelluläre Morphologie. Die Strahlenreaktion humaner Tumorzellen in vitro nach Hemmung der Autophagie führte bei fraktionierter Bestrahlung zu einer Radiosensitivierung in den Zelllinien HTB43 und HTB35 und zu einer moderaten Strahlenreaktion in der Zelllinie MDA-MB-231. Diese Arbeit belegt, dass die Autophagie einen essentiellen Schutzmechanismus humaner Tumorzellen gegenüber Bestrahlung darstellt, und ihre Funktion direkt in die klonogene Überlebensfähigkeit der Zellen involviert ist. Dies macht Autophagie zu einem Ansatzpunkt für Antitumortherapien, speziell für die Kombinationstherapie mit Bestrahlung.

This work showed in two different systems the role of the lysosome and the vacuole as targets for therapeutical application. In the Candida albicans studies it could be shown that the fungal vacuole and its function influence virulence of Candida albicans. Therefore, ten candidate genes with known function in Saccharomyces cerevisiae were selected and their sequences were identified in the Candida albicans genome. The genes were deleted in C. albicans and the morphology of the resulting null mutants was analyzed. Hyphal integrity was examined by yeast-to-hyphae transition. The virulence of all strains was tested in the mouse model for systemic candidosis. The deletion of genes required for maintenance of vacuolar integrity influenced vacuolar morphology, the yeast-to-hyphae transition, and virulence in a mouse model for systemic Candidosis. The reduction of virulence correlated with the degree of vacuolar fragmentation and function. Deletion of the Rab-GTPase CaYPT7 led to a strong fragmentation of the vacuolar compartment, a significant reduction in hyphal length, and a drastically decreased virulence. This work shows that vacuole biogenesis and function are directly involved in virulence of Candida albicans. That makes this cell compartment a target for antifungal therapy. In the studies with tumour cells it could be shown that autophagy and its function influence the radiation reaction of human tumour cell lines. To proof this, six genes involved in autophagosome formation were selected. Their expression was specifically inhibited by siRNAs. The inhibition of gene expression was tested on RNA and protein level. The ability of transfected cells to autophagosome formation after irradiation was analyzed by electron and fluorescence microscopy. The impact of transfected tumour cells on clonogenic survival after irradiation was examined by colony formation assay. Gene inhibition by siRNA led to a stable blocking of expression. The inhibition of genes required for autophagosome formation influenced cellular morphology qualitatively and quantitatively. The radiation reaction after fractionated irradiation of human tumour cells in vitro after inhibition of autophagy led to a radiosensitization in the cell lines HTB43 and HTB35 and to a moderate radiation reaction in the cell line MDA-MB-231. This work shows that autophagy represents an essential defence mechanism of human tumour cells against irradiation, and its function is directly involved in cellular survivability. This makes autophagy a target for anti-tumour therapy especially in combination with irradiation.