Charakterisierung der Oberflächensialylierung von dendritischen Zellen und T-Zellen in unterschiedlichen Funktionszuständen sowie Untersuchung der Expression und der biochemischen Eigenschaften von CD83-Liganden

Abstract

Dendritische Zellen (DC) sind potente antigenpräsentierende Zellen und können gegen das jeweilige Antigen entweder eine Immunantwort oder aber für dieses immunologische Toleranz induzieren. Bisher sind hauptsächlich Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht worden, ohne dass schlüssig der Mechanismus der Toleranzinduktion bei unreifen DC und regulatorischen T-Zellen aufgeklärt werden konnte. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Sialylierung von Oberflächenproteinen mit den Lektinen SNL und MAL II, sowie die Spezifität von CD83 als Lektin untersucht. Von Monozyten abgeleitete DC reduzieren im Laufe ihrer Reifung die alpha2,6-Sialinsäuredichte auf der Zelloberfläche. Dies geht einher mit der Umstellung von Toleranzinduktion auf Immunstimulation dieser antigenpräsentierenden Zellen. Darüber hinaus wurden andere wichtige Suppressorzellen in unserem Immunsystem, die regulatorischen T-Zellen (Treg), analysiert. Auch hier wurde eine Zunahme der alpha2,6-Sialinsäuredichte auf der Zelloberfläche durch polyklonale Stimulierung gefunden. Da CD8+ T-Zellen inhibitorische Sialinsäure-bindende Rezeptoren exprimieren, kann diesem Phänotyp funktionelle Bedeutung zukommen. Im Gegensatz zu den regulatorischen Zellen zeigten immunomagnetisch aufgereinigte CD8+ zytotoxische T-Zellen bei Stimulierung eine Verringerung der alpha2,6-Sialinsäuredichte. Interessanterweise wurde die Dichte von alpha2,6-verknüpfter Sialinsäure auf CD8+ zytotoxischen T-Zellen jedoch nicht verringert, wenn sie zusammen mit CD4+ T-Zellen inkubiert wurden. Dies weist auf die inhibitorische Wirkung der CD4+CD25+ Treg in dieser Kultur hin. Die Dichte an alpha2,3-verknüpfter Sialinsäure blieb unabhängig von den Kulturbedingungen weitgehend gleich. Für die Vermittlung des inhibitorischen Signals, das von der Sialinsäure ausgeht, ist die Rezeptorfamilie der Siglecs (Sialic acid-binding immunoglobuline-like lectins) wichtig. Die meisten der elf Mitglieder, die mit einer Ausnahme auf Zellen des Immunsystems exprimiert werden, besitzen ein intrazelluläres ITIM-ähnliches Motiv, das ein inhibitorisches Signal generiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Verfahren zur Expression von rekombinanten Siglec-Fusionsproteinen etabliert werden. Bisher sind DC mit den etablierten Stimulationsverfahren zu ineffektiv, um eine wirksame T-Zellantwort gegen Malignome im Menschen zu generieren. Deshalb wurde begonnen, das Oberflächenprotein CD83 zu analysieren, das reife, aktivierte DC exprimieren. Der Ligand von CD83 ist unbekannt und auch eine ihn exprimierende Zellpopulation konnte bisher aufgrund der niedrigen Affinität des CD83-Moleküls für seinen Liganden nicht eindeutig identifiziert werden. Die extrazelluläre Domäne des humanen CD83-Moleküls wurde kloniert, rekombinant in eukaryotischen 293-Zellen exprimiert und aufgereinigt. Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen CD83 und der Siglec-Familie wurde bereits früh angenommen, dass der Ligand ein glykosyliertes Molekül ist. Da die Affinität zwischen Lektinen und ihren glykosylierten Liganden oft sehr gering ist, wurde das CD83-Fusionsprotein tetramerisiert um die Avidität zu erhöhen. Mit diesem Instrument konnte der Ligand auf apoptotischen und nekrotischen Zellen, insbesondere auf Thymozyten und Lymphozyten, nachgewiesen werden. Ein Glycan Array und Versuche mit dem N-Glykosylierungshemmer Tunicamycin geben Hinweise darauf, dass es sich beim Liganden von CD83 um ein N-glykosyliertes Molekül handelt. Die Ergebnisse des Glycan Array lassen darauf schließen, dass Fucose und Sialinsäure mögliche Bestandteile des Bindungsmotivs sind. Immunstimulatorische und toleranzinduzierende Zellen des Immunsystems unterscheiden sich deutlich in ihrem Sialylierungsmuster. Das bessere Verständnis der Sialylierung einerseits und Sialinsäure-bindender Rezeptoren andererseits kann dazu beitragen, die Effizienz immuntherapeutischer Verfahren zu steigern.

Dendritic cells (DC) are potent antigen presenting cells and can induce either immune response or tolerance towards an antigen. To date mainly protein-protein interactions have been under investigation. The results cannot fully explain the mechanism of tolerance induction of immature DC and regulatory T cells. The sialylation of cell surface proteins with the lectins Sambucus nigra lectin and Maackia amurensis lectin II was investigated, as well as the specificity of CD83 as a lectin. During their maturation monocyte-derived dendritic cells reduce the density of alpha2,6-linked sialic acid on their cell surface. During the same time there is a switch from tolerance induction to immune stimulation of these antigen presenting cells. On another tolerogenic population, the CD4+CD25+ regulatory T cells, the density of alpha2,6-linked sialic acid was found to be increased under polyclonal stimulation in the presence of high amounts of IL-2. Since CD8+ T cells can have inhibitory sialic acid binding receptors on their surface (siglec-7 and siglec-9), this phenotype can be important. In contrast to regulatory cells, cytotoxic CD8+ T cells which have been isolated by immunomagnetic cell separation showed a reduction of the alpha2,6-linked sialic acid density under stimulatory conditions. Interestingly, the density of the alpha2,6-linked sialic acid density on cytotoxic CD8+ T lymphocytes was not reduced when they were coincubated with CD4+ T cells in a mixed lymphocyte reaction. This might indicate an inhibitory function of CD4+CD25+ T cells present in this culture. The density of alpha2,3-linked sialic acid remained largely unchanged, independent of the cell culture conditions. It is known that siglecs (Sialic acid-binding immunoglobuline-like lectins) mediate the inhibitory signal originating from sialic acid residues. All except one of the eleven siglecs are expressed on cells of the immune system and most of them have an intracellular ITIM-like motif generating an inhibitory signal. A protocol to express recombinant siglec fusion proteins was established during this work. Until now the techniques to generate DC, which are supposed to induce effective T cell responses against malignancies in humans, are still not effective enough. Therefore the cell surface protein CD83 expressed by mature activated DC was analysed. The ligand of CD83 is still unknown. The extracellular domain of human CD83 has been cloned and expressed in eucaryotic 293 cells. Due to the homology between CD83 and the siglec family it was assumed that the ligand for CD83 is a glycosylated molecule. The affinity of lectins towards their ligands is often very low. Therefore CD83 was tetramerized in order to have a greater avidity. With this instrument it was possible to detect the CD83 ligand on thymocytes and lymphocytes in the apoptotic and necrotic state. A Glycan Array and experiments with the N-glycosylation inhibitor tunicamycin showed that CD83 ligand is likely to be an N-glycosylated molecule. Sialic acid and fucose are part of the binding motif. Immunstimmulatory and tolerance inducing cells in the immune system differ in their sialylation pattern. Better understanding of the sialylation on one side and sialic acid binding receptors on the other side can contribute to make immunotherapeutic strategies of malignancies more effective.