Functions and target selection of Arabidopsis microRNAs

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-22546
http://hdl.handle.net/10900/48898
Dokumentart: Dissertation
Date: 2006
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Biologie
Advisor: Weigel, Detlef
Day of Oral Examination: 2006-03-29
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Ackerschmalwand , Entwicklungsbiologie , Posttranskriptionelle Regulation , RNS
Other Keywords: microRNA , Arabidopsis , Entwicklung , Genregulation
microRNA , gene regulation , Arabidopsis , development , gene silencing
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Inhaltszusammenfassung:

Die Regulierung der zellulären Gen-Aktivität spielt eine entscheidende Rolle in der Entwicklung vielzelliger Organismen, da sie die lokale Spezifizierung verschiedener Zell-Identitäten ermöglicht. Eine Vielzahl molekularer Komponenten beeinflusst die Expression einzelner Gene, unter anderen auch regulatorische RNAs. Diese gehören oft zur Klasse der kleinen RNAs von nur 19 bis 25 Nukleotiden Länge, die durch komplementäre Basenpaarung eine selektive Bindung and Ziel-Gene erreicht, welche sie in der Regel negativ beeinflusst. MicroRNAs sind eine Gruppe kleiner RNAs, die wie Proteine im Genom kodiert werden, und meist an Boten-RNAs binden. In Pflanzen zeigen diese meist hohe Sequenz-Komplementarität zur jeweiligen microRNA und werden in der Regel am Ort der microRNA-Bindung gespalten, wobei die resultierenden Produkte abgebaut werden. In Tieren erfolgt in den meisten Fällen ein Block der Protein-Synthese der jeweiligen Ziel-Gene, welche aufgrund der geringen erforderlichen Sequenz-Komplementarität oft sehr zahlreich sind. MicroRNAs wurden erst vor wenigen Jahren als zentraler Bestandteil der Genregulation beschrieben, sodass viele Eigenschaften ihrer biochemischen Funktionalität als auch ihrer biologischen Relevanz noch nicht beschrieben worden sind. Im Rahmen dieser Dissertation wurden verschiedene funktionale Aspekte von microRNAs in der Modell-Pflanze Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) untersucht. 1. Biologische Relevanz einzelner microRNAs Die gezielte Über- und Misexpression einzelner microRNAs führte zu verschiedenen phänotypischen Abnormalitäten, welche sich zum Teil durch bekannte Rollen einzelner Ziel-Gene erklären ließen, aber auch weitreichendere Funktionen der microRNAs in der Regulation von Entwicklungsprozessen absehen ließen. Sie erlaubten ferner den Schluss, dass eine koordinierte räumliche und zeitliche Akkumulation von microRNAs von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung der Pflanze ist. 2. Ziel-Gene von microRNAs Die meisten bisher bekannten microRNA Ziel-Gene in Pflanzen wurden aufgrund ihrer sehr hohen Sequenz-Komplementarität vorhergesagt, und in vielen Fällen auch bestätigt. Nicht bekannt hingegen war, ob es weitere Ziel-Gene mit geringerer Sequenz-Komplementarität geben würde. Da pflanzliche microRNAs in der Regel die Spaltung ihrer Ziel-RNAs bewirken, sollte deren Expressionsniveau in Gegenwart erhöhter microRNA Mengen verringert sein. Dies wurde mit Hilfe von Microarrays in vielen Fällen bestätigt. Microarrays erlaubten außerdem genomweite Studien zur veränderten Genexpression in microRNA überproduzierenden Pflanzen, und damit eine Beschreibung der vollständigen Zahl von microRNA Ziel-Genen. Diese war in allen fünf analysierten Fällen sehr gering, im Gegensatz zu den meisten bekannten tierischen microRNAs. In der Folge wurden die ermittelten Ziel-Gene zum Vergleich mit anderen Genen herangezogen, was zur Formulierung von Sequenz-Determinanten zur Selektion von microRNA Ziel-Genen führte. 3. Künstliche microRNAs Unter Beachtung der ermittelten Sequenz-Determinanten von microRNA Ziel-Genen wurden künstliche microRNAs generiert, welche der negativen Regulierung endogener, normalerweise nicht von microRNAs regulierten Genen dienen sollten. Diese künstlichen microRNAs zeigten ein ebenso enges Wirkspektrum wie endogene microRNAs, was den Schluss erlaubte, dass einzig die involvierten enzymatischen Komponenten für diese Spezifität verantwortlich sind. Somit können microRNAs zur gezielten Regulierung einzelner oder mehrerer Gene herangezogen werden. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass die Genregulation durch künstliche microRNAs auch unter gewebespezifischen und induzierbaren Promotoren erfolgreich ist, und weitgehend zellautonome Effekte induziert.

Abstract:

Spatial and temporal control of gene activity is a prerequisite of multicellular development, as the local accumulation of gene products is required to specify different cell fates. The regulation of gene expression involves a large number of different effectors, and also single-stranded RNAs of ~19-25 nucleotides in length. MicroRNAs (miRNAs) constitute a large group of endogenous small RNAs, and they negatively regulate their target genes by base-pairing to complementary nucleic acids. In animals, miRNAs typically trigger translational arrest of their targets, to which they pair with only limited complementarity. Plant miRNAs, on contrary, trigger cleavage of target transcripts, with which they share high sequence complementarity. Predictions of new plant miRNA targets have therefore focused on genes with only a small number of mismatches to miRNAs. Studying the biological function of three plant miRNAs, I have over- and misexpressed their precursors in Arabidopsis thaliana. The different abnormalities, which could be observed in transgenic plants, strongly suggest a role of these miRNAs as regulators of plant development. Overexpression of miR156 extended the vegetative phase of Arabidopsis seedlings, and also increased the speed and number of organ initiation events. Conversely, miR172 was shown to decrease the time of vegetative development when overexpressed, and also to control floral organ identity. MiRNA164 was shown to control separation of above ground organs throughout the life cycle of Arabidopsis plants. The observed defects can be partially correlated with known loss-of-function mutants in predicted target genes, however they also postulate additional miRNA functions. These might be mediated by other predicted target genes, which had not been functionally characterized before. I have studied direct effects of miRNA expression on target RNA accumulation and confirmed that many predicted target genes were strongly responsive to miRNA overaccumulation. This finding is consistent with phenotypes of miRNA overexpressers resembling mutants in target genes, and also with cleavage of mRNAs as the mode of plant miRNA function. In order to test for the presence of additional targets with similar or lower sequence complementarity, I monitored genome-wide expression changes caused by overexpression of five different miRNAs. In brief, these analyses suggest that plant miRNAs directly regulate only a very small number of target genes, to which they pair with high sequence complementarity. Comparing authentic miRNA targets to other, non-responsive genes with similar mismatch numbers, I established positional determinants of plant miRNA target selection. These, unlike previous computational efforts, almost unambiguously discriminate targets from non-targets not only in the small set of miRNAs analyzed, but also when compared to other plant miRNAs. Feedback regulation can add another level of complexity to miRNA mediated effects, as I have discovered for the case of miR172. It has been previously suggested that miR172 overexpression results in changes of target protein, rather than transcript abundance, and translational inhibition was proposed as a mechanistic basis. However, since cleavage of target transcripts was efficiently increased in miR172 overexpressing tissue, additional regulatory events have to be present. To uncouple miRNA mediated from other effects on target genes, I overexpressed a miRNA resistant version of the target gene AP2, and confirmed the presence of a negative feedback of AP2 on its own expression. This suggests that miR172 functions by simultaneously triggering cleavage and translational inhibition of its target genes. Since the action spectrum of plant miRNAs is very narrow, it contrasts with the broad selectivity of animal miRNAs. This difference might reflect either only intrinsic properties of the plant miRNA machinery, or selection against miRNAs with broader specificity has reduced the number of plant miRNA targets. In order to distinguish between the two possibilities, I have generated artificial miRNAs (amiRNAs) targeting endogenous genes and found that their specificity was as high as that of natural plant miRNAs. This finding supports the idea that extensive basepairing with target genes is required for plant miRNA function. Since amiRNAs were efficiently produced and could be designed to specifically silence single, or groups of endogenous genes, they can easily be used as a tool for directed gene silencing in plants. In addition to conventional silencing of single genes, which is already possible by RNA interference, amiRNAs can specifically downregulate expression of multiple related genes. As they function with high specificity, they can potentially also function in strand or allele specific gene silencing, which is not possible by other means. Furthermore, introduction of amiRNA-insensitive variants of targets can be generates to compensate for defects in amiRNA expressing plants. A web-based tool has been established to automatically design amiRNAs for genes of interest and is available to the scientific community for further studies.

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