Functional characterisation of aquaporins from Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii und Trypanosoma brucei

Abstract

P. falciparum, T. gondii and T. brucei parasites cause infectious diseases that affect more than 300-400 million people world-wide and, thus, represent a major health problem. The rapid spreading of drug resistant parasite strains initiated the search for new drug targets.

Aquaporins at the parasite host interface have the potential to be used as a novel targets. I characterised biochemically a single T. gondii aquaporin (TgAQP) which has only 28% sequence similarity to the P. falciparum aquaporin (PfAQP) and 47% sequence similarity to water specific plant aquaporins (TIP 1;1) and three T. brucei aquaporins (TbAQP1-3) which show 40-45% similarity to mammalian AQP3.

The pore constriction region of TgAQP has a valine instead of a highly conserved arginine. This exchange is rather typical for above-mentioned plant aquaporins. Thus, it supports the hypothesis that apicomplexans have plant ancestors. TbAQP1 and 3 have a similar amino acid composition in the pore constriction as AQP3. TbAQP2, however, has a leucine instead of the pore arginine, and NSA and NPS motifs instead of the canonical NPA motifs.

I established that TgAQP and the TbAQPs are bifunctional pores with high glycerol and intermediate water permeability whereas in PfAQP both, water and glycerol permeability are high.

Further testing of TgAQP permeability showed that besides urea, which passes the pore equally well as glycerol, only erythritol and D-arabitol reasonably permeate TgAQP. Other larger and/or charged compounds do not pass. Strikingly, hydroxyurea, an anti-neoplastic agent with an inhibitory effect on parasite proliferation, could be identified as a permeant of TgAQP.

Solute permeability TbAQPs is more restricted. Only TbAQP3 passed erythrytol and ribitol well. TbAQP2 showed permeability for pyruvate. All TbAQPs passed urea.

The TbAQPs and PfAQP were further highly permeable for dihydroxyacetone (DHA). I could show that DHA is toxic for plasmodia parasites (IC50 2.5 mM). PfAQP was also tested for methylglyoxal (MG) permeability. MG is a side product of glycolysis and has a similar structure as DHA. MG was conducted by PfAQP and showed a toxic effect on malaria parasites (IC50 200 µM). P. falciparum glyceraldehydes phosphate dehydrogenase (PfGAPDH) was fully inhibited by 2.5 mM DHA after 6 h whereas MG did not have an inhibitory effect. Rabbit GAPDH as a control was fully inhibited by DHA after 3 h and by MG after 20h.

In addition, PfAQP is permeable for ammonia. I showed that one liter of packed plasmodia red cells produces 8.8 mmol of ammonia of ammonia per hour. PfAQP may thus be vital for malaria parasites as a pathway for ammonia release.

P. falciparum, T. gondii und T brucei Parasiten verursachen Infektionskrankheiten, die mehr als 300-400 Millionen Menschen auf der Welt betreffen und stellen ein großes Gesundheitsproblem dar. Die schnelle Ausbreitung von resistenten Stämmen löste die Suche nach neuen Angriffspunkten für Medikamente aus. Aquaporine im Membransystem zwischen Parasit und Wirt könnten als neue Angriffspunkte für Medikamente genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden ein Aquaporin aus T. gondii (TgAQP) sowie drei Aquaporine aus T. brucei (TbAQP1-3) biochemisch charakterisiert.

TgAQP zeigt 28% Sequenzähnhichkeit zu dem Auqaglyceroporin aus P. falciparum (PfAQP) und 47% Sequenzähnhichkeit zu wasserspezifischen Pflanzenaquaporinen (TIP 1;1). TbAQP1-3 weisen 40-45% Ähnhichkeit zu AQP3 aus Säugern auf.

In der Porenregion von TgAQP, befindet sich ein Valin anstelle eines hochkonservierten Arginins. Dieser Aminosäurenaustausch ist typisch für die TIPs der Pflanzen und stützt die Hypothese, dass Apicomplexa pflanzliche Vorfahren haben. TbAQP1 und 3 haben eine ähnliche Aminosäurenzusammensetzung der Porenregion wie AQP3 und NPA Motive in der Region, die den Porenengpass bildet. TbAQP2 bildet eine Ausnahme, da es ein Leucin anstelle des Arginins hat und NSA und NPS Motive aufweist.

Es wurde gezeigt, dass TgAQP und TbAQPs bifunktionale Poren sind, die durch eine hohe Permeabilität für Glycerin und eine mittlere Wasserpermeabilität gekennzeichnet sind. PfAQP hingegen hat eine hohe Permeabilität für sowohl Glycerin als auch Wasser.

Die weitere Untersuchung der Permeabilität von TgAQP ergab, dass neben Harnstoff, der die Pore ebenso gut wie Wasser passiert, auch Erythritol und D-Arabitol eine gewisse Durchgangigkeit besitzen. Fur andere Verbindungen, die groser und/oder geladen sind, ist TgAQP nicht durchlässig. Interessanterweise kann Hydroxyharnstoff, ein anti-neoplastischer Wirkstoff, der die Parasitenproliferation inhibiert, durch die Pore dringen. Die Solutleitfähigkeit der TbAQPe ist eingeschränkt. Nur TbAQP3 lässt Erythritol und Ribitol pasieren. TbAQP2 hat eine geringe Permeabilität fur Pyruvat. Alle TbAQPe sind permeabel fur Harnstoff.

Sowohl die TbAQPs als auch PfAQP haben eine hohe Durchlässigkeit fur Dihydroxyaceton (DHA). Es wurde nachgewiesen, dass DHA fur die Plasmodienparasiten toxisch ist (IC50 2,5 mM). PfAQP wurde positiv auf Permeabilität von Methylglyoxal (MG) getestet. MG ist ein Nebenprodukt der Glykolyse und hat eine ähnliche Struktur wie DHA. Das von PfAQP eingeschleuste DHA wirkte toxisch auf die Malariaparasiten (IC50 200 µM). Des weiterem wurde die Auswirkung von 2,5 mM DHA bzw. MG auf P. falciparum Glycerolaldehyd-Dehydrogenase (PfGAPDH) untersucht. PfGAPDH wird nach 6 h vollständig von DHA inhibiert, wohingegen MG keinen inhibitorischen Effekt zeigt. Als Kontrolle wurde GAPDH aus dem Kaninchen verwendet, das von DHA nach 3 h und von MG nach 20 h vollständig inhibiert wird.

PfAQP ist auch durchlässig für Ammoniak. Es wurde gezeigt, dass ein Liter gepackter malariainfizierter Erythrozyten 8,8 mmol Ammoniak pro Stunde produzieren. PfAQP konnte demnach überlebenswichtig fur Plasmodien sein und als Anlass für Ammoniak fungieren.