Identification of novel ubiquitin-proteasome dependent pathways in Arabidopsis thaliana

Abstract

In general terms, the purpose of this work is the identification of the cellular processes in Arabidopsis that require ubiquitin-mediated degradation, through the specific characterization of a set of novel FBPs, as well as one putative target for degradation, and the presentation of a technology that should allow the identification of unstable ubiquitin-regulated proteins.

Ubiquitin (Ub)-vermittelte Proteolyse ist ein wichtiger regulatorischer Mechanismus in eukaryotischen Organismen. Hierbei binden E3 Ubiquitinligasen spezifisch an für den Abbau vorgesehene Substrate und vermitteln deren Ubiquitylierung. Diese ist eine notwendige Voraussetzung für den Abbau durch das 26S Proteasom. In Hefe- und Säugerzellen regulieren die E3 Ubiquitinligasen des SCF-Typs essentielle Prozesse durch Wachstum und Entwicklung wie den Zellzyklus. Arabidopsis weist eine erstaunlich hohe Zahl (694, ~ 2,5% des Proteoms) an F-box Proteinen (FBPs) auf, die die substratbindenden Komponenten der SCF Komplexe darstellen. Dies legt die Vermutung nahe, dass SCF Komplexe in Pflanzen für zahlreiche zelluläre und entwickungsbiologische Prozesse von Bedeutung sind. Trotz dieser offensichtlich zentralen Rolle ist bisher die biologische Funktion von nur wenigen FBPs bzw. SCF-Komplexen verstanden. Die vorgelegte Arbeit läßt sich in drei Bereiche aufteilen (i) die Charakterisierung des FBPs AtFBP7 und der VIER F-Box PROTEINE (VFB) Familie als neue, bisher nicht untersuchte, FBPs von Arabidopsis, (ii) die Untersuchung des TOUGH Proteins, einem vermeintlichen Proteinabbausubstrat, (iii) und die Einführung der LucTrap Vektoren mit deren Hilfe neue unstabile Proteine identifiziert und untersucht werden können. Ergänzender Bestandteil der Dissertation ist ein Übersichtsartikel, welcher anhand spezifischer relevanter Beispiele das bisherige Wissen über den Ubiquitin-Proteasom-abhängigen Proteinabbau bei Pflanzen gibt. Das evolutionär konservierte F-Box Protein AtFBP7 konnte als essentiell für die Proteinsynthese nach Temperaturstress nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis bestätigt die Vermutung nach einer ursprünglichen Funktion in einem konservierten biologischen Prozess. Die pflanzenspezifischen VFBs gehören zu der bisher am besten charakterisierten C3 Subfamilie der FBP Superfamilie bei Arabidopsis. Es wurde gezeigt, dass der Verlust der VFB Funktion zu verzögertem Wachstum und verminderter Seitenwurzelbildung führt und mit einer Expressionsreduktion Auxin-responsiver Gene einhergeht. Die fortlaufende Forschung in unserem Labor zu den VFBs wird neues Licht auf die Mechanismen werfen, die durch VFBs reguliert sind. Die Identifizierung der durch das Ubiquitin-Proteasomsystem abgebauten Proteine stellt eine grosse Herausforderung dar. Das Problem liegt darin, dass diese aufgrund ihres schnellen Umsatzes und weil sie keine charakterisierten Erkennungssequenzen tragen, nur schwer zu identifizieren sind. Das Protein TOUGH ist eines dieser putativen Abbau-Substrate, für das man zeigen konnte, dass es eine wichtige Rolle während der pflanzlichen Entwicklung besonders bei der Differenzierung der Leitbündel spielt. Weitere Proteinabbausubstrate können in Zukunft mit Hilfe der ebenfalls in dieser Dissertation beschriebenen LucTrap Technologie identifiziert werden.