Markierungsfreie Untersuchung biochemischer Erkennung und die Charakterisierung der Adhäsionseigenschaften von Zellen im Flusssystem

Abstract

In dieser Arbeit werden verschiedene biochemische Erkennungsreaktionen markierungsfrei untersucht und quantifiziert. Dies erfolgt mit der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS). Die RIfS basiert auf der Reflexion von eingestrahltem Weißlicht an dünnen Schichten. Die reflektierten Teilstrahlen interferieren konstruktiv oder destruktiv miteinander - abhängig von ihrer Wellenlänge, den Brechungsindices der optischen Medien und der Weglängendifferenz (also der optischen Schichtdicke). Das erhaltene Interferenzspektrum verschiebt sich bei einer Zunahme der optischen Schichtdicke hin zu längeren Wellenlängen. Verfolgt man die Verschiebung des Interferenzspektrums, so kann man Bindungsereignisse auf der Oberfläche markierungsfrei und zeitaufgelöst beobachten. Oligonukleotide, die das Monomer LNA (Locked Nucleic Acid) enthalten, zeigen eine erhöhte thermische Stabilität und eine größere Stabilität gegenüber Nukleasen. Die höheren Schmelztemperaturen sind das Resultat einer stärkeren Affinität zwischen den LNA Monomeren und ihren komplementären Basen. Dies wurde durch den Vergleich der Affinitätskonstanten der Hybridisierung dreier Oligonukleotiden (ein DNA Oligomer, ein LNA-DNA-Mixmer, bei dem jede Thymin-Base durch ein LNA-Monomer ersetzt wurde, und ein LNA Oligonukleotid) zu ihrem komplementären DNA-Einzelstrang gezeigt. Mit der Entwicklung eines Biosensors für die Diagnostik von Autoimmunantikörpern gegen die Erkrankung Zöliakie wurde untersucht, ob Biosensoren basierend auf der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie für den Einsatz in der medizinischen Diagnostik geeignet sind. Blutserum zählt zu den komplexesten Matrices im Bereich der Detektion auf planaren optischen Transducern. Trotzdem konnten, durch die Verwendung einer ausgereiften Oberflächenchemie, die Autoimmunantikörper gegen die Transglutaminase im Blutserum von Zöliakie-Patienten markierungsfrei detektiert werden. Die Untersuchung der Wechselwirkung des Proteins SRF (Serum Response Faktor) zu einem Erkennungspeptid, dessen Sequenz die der B-Box entspricht, zeigt, dass sich RIfS für die Untersuchung schwacher Protein-Protein-Wechselwirkungen von Signalproteinen eignet. Zum weiteren Einsatz der RIfS in der Proteomanalyse wird die Verwendung von elektrisch leitenden ITO-(Indium-Zinn-Oxid)-Transducer-Oberflächen für die Kopplung von RIfS mit der MALDI-Massenspektrometrie untersucht. Die Aktivierung von T-Zellen wird durch Antigen-spezifische Kreuzvernetzung des T-Zell-Rezeptor/CD3-Komplexes durch einen MHC-Peptid-Komplex der Antigen-Präsentierenden Zelle ausgelöst. Stimulation von T-Zellen durch mit anti-CD3-Antikörpern funktionalisierte Oberflächen löst eine Adhäsion und Ausbreitung der Zellen aus, wobei die Protein-Tyrosin-Kinase Lck eine zentrale Rolle spielt. Zur Untersuchung von Adhäsionseigenschaften von T-Zellen wurden anti-CD3-Antikörper auf planaren Transducern über 3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan (GOPTS) immobilisiert und anschließend die Adhäsion der Zellen in einem Flusssystem beobachtet. Dabei wurden die Adhäsionseigenschaften von Jurkat T-Zellen und der Lck-defizienten Zelllinie Jurkat JCaM 1.6 verglichen. Im Flusssystem korrelierte die Signalintensität in der RIfS mit der Oberflächenexpression von CD3 Molekülen und der Aktivität der Lck-Kinase. Die Charakterisierung von Zelladhäsion durch RIfS im Flusssystem gibt uns eine Methode an die Hand, markierungsfrei und in Echtzeit Prozesse der Zell-Zell-Wechselwirkung zu untersuchen, wie sie im Immunsystem vorkommen.

In this work biochemical recognition of different interaction partners were analyzed and quantified. This was done by using the label-free and time resolved detection method reflectometric interference spectroscopy (RIfS). RIfS is based on multiple reflections at thin layers. Therefore, white light is guided with an optical fibre to the transduction layer. At each interface between different refractive indices, the light is partially reflected. These reflected beams superimpose and build a characteristic interference spectrum, which is detected with a diode-array. The interaction of bio molecules and cells with the transducer surface results in a change of the optical thickness of the latter layer. This causes a change in the reflectance spectrum. With this, bio molecular interactions can be observed time resolved and label-free. Oligonucleotides containing LNA monomers show an enhanced thermal stability and robustness against nuclease mediated cleavage. Therefore special tailored LNA is a versatile tool for gene array analysis and SNP analysis. The higher melting temperatures are the result of a higher affinity between the LNA and its complementary base. This was verified by determination of the affinity constants of the duplex formation of 3 oligonucleotides: DNA, L-DNA, in which all thymidines are substituted by LNA, and a fully modified LNA to their complementary DNA strand. Affinity constants were calculated to . With the development of a biosensor for the detection of auto immune antibodies in blood serum, the suitability of biosensors for clinical diagnostics based on the RIfS method is shown. Although blood serum is known as a very complex matrix for the label-free detection on planar transducers, it was possible to detect auto immune antibodies against the transglutaminase of celiac disease patients. With the detection of the interaction of the protein SRF (serum response factor) to a peptide, having the sequence of the B-Box, the characterization of protein-peptide interaction with RIfS is demonstrated. To improve the coupling of RIfS with the MALDI mass spectrometry the use of the conductive material ITO (indium-tin-oxide) for RIfS detection is shown. RIfS also enables the detection of the adhesion of tissue culture cells to a functionalized surface in a flow system. Jurkat T cell leukemia cells rapidly attached to a transducer functionalized with a monoclonal antibody directed against the T cell receptor (TCR)/CD3 complex followed by activation-dependent cell spreading. For the Jurkat derivative JCaM 1.6 that lacks the key signalling protein Lck, cells preincubated with the inhibitor of actin polymerization cytochalasin D, and for surfaces functionalized with an antibody directed against the co-receptor CD28, RIfS curves were obtained that differed with respect to the maximum signal and the initial slope of the increase in optical thickness. Interactions of T cells with other leukocytes or epithelial cells of blood vessels are crucial steps for the regulation of the immune response and inflammatory reactions.