Veränderungen des an Chromatin assoziierten Subproteoms von T24 (Blasen-) Krebszellen in Zusammenhang mit der schnell wirkenden sauerstoffabhängigen Kontrolle der DNA-Replikation

Abstract

Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, durch globale Analyse der an das Chromatin menschlicher Zellen assoziierten Proteine nach neuen, bislang in diesem Zusammenhang evtl. unerkannt gebliebenen Proteinakteuren im Ablauf der schnellen sauerstoffabhängigen Regulation der DNA-Replikation von Säugerzellen zu fahnden. Aufbauend auf vorangegangenen Studien an Minichromosomen von Simian Virus 40 (SV40) sollten dazu insbesondere die Techniken der Proteomanalytik verwendet werden. Die O2-abhängige Regulation der DNA-Replikation beeinflusst vor allem die Initiation von Replikationseinheiten (Replikons) in proliferierenden Zellen. Der für die Initiation notwendige Multiproteinkomplex (der sog. Initiationskomplex) wird in einer komplizierten, mehrere Stunden dauernden Abfolge von Reaktionen zusammengesetzt. Unter Hypoxie wird dieser Komplex zwar sehr weitgehend, jedoch noch nicht vollständig und funktionsfähig assembliert; die entscheidenden letzten Schritte bleiben unterdrückt. Durch die Wiederzufuhr von O2 (Reoxygenierung) können die unter Hypoxie aufgestauten Initiationen dann schwallartig – innerhalb weniger Minuten – auslöst werden. Die vorliegende Suche galt u. a. bislang möglicherweise unerkannt gebliebenen Proteinen, die evtl. an diesen letzten, entscheidenden Schritten beteiligt sind. Es sollte global nach an Chromatin assoziierten Proteinen gesucht werden, deren Menge oder Zustand sich innerhalb der ersten Minuten nach Reoxygenierung hypoxischer Zellen gegenüber dem Zustand unter Hypoxie deutlich ändert. Die Übertragung von der verhältnismäßig einfachen Virusreplikation auf die zelleigene DNA-Replikation und die Analyse des – im Vergleich zu den SV40-Minichromosomen deutlich anders organisierten – zellulären Chromatins bedingten umfangreiche methodische Vorarbeiten und Optimierungen.

Als Untersuchungsobjekt wurden nach umfangreichen Voruntersuchungen T24-Zellen (menschliches Blasenkarzinom) gewählt, weil sie – wie in dieser Arbeit gezeigt wurde – durch Aushungern in einen reversiblen G1-Arrest gebracht werden können und weil ihre O2-abhängige Regulation der DNA-Replikation in gut versorgten Zellen besonders markant auf die entsprechenden Änderungen des pO2 anspricht. In G1 arretierte Zellen wurden durch Erneuerung des Kulturmediums stimuliert und anschließend einige Stunden hypoxisch inkubiert. Dadurch wurden die frühen (am Anfang der S-Phase replizierenden) Replikons in initiationsbereitem Zustand akkumuliert. Zellproben aus dem Zustand kurz vor Ende der Hypoxie und aus den ersten 30 Minuten nach Reoxygenierung wurden der Analyse zugeführt. Die Optimierung dieses Synchronisierungsprotokolls wird beschrieben. Der Einfluss der relevanten, frei wählbaren Parameter auf den angestrebten Erfolg wird charakterisiert. Das optimierte Protokoll liefert Zellpopulationen, in denen 80 - 90% aller Zellen auf Reoxygenierung synchron mit der Initiation der – bei Beginn der bevorstehenden S-Phase zu aktivierenden – Replikons antworten. Zur Abtrennung der Chromatin assoziierten Proteine vom übrigen Zellproteom wurde ein (zuvor für Hefezellen eingesetztes) Verfahren gewählt, bei dem lösliche oder nur locker an den Chromatin-Kernmatrix-Komplex gebundene Proteine (operative Bezeichnung "Nucleosol"-Proteine) mit einem Triton X100 enthaltenden Puffer aus isolierten Zellkernen eluiert werden. Das verbleibende Material ("extrahierte Zellkerne") enthält – im Gegensatz zu der Minichromosomen-Fraktion bei SV40 – neben Chromatin und den direkt an Chromatin gebundenen Proteinen zusätzlich die Kernmatrix sowie an diese assoziierte Proteine. Das Verfahren zur Präparation dieser Zellfraktion wurde im Hinblick auf die nachfolgende Proteomanalyse durch 2D-Elektrophorese optimiert. Diese wiederum war ebenfalls für das spezielle Untersuchungsmaterial anzupassen und zu optimieren. Ein (optionaler) zusatzlicher Schritt zur Entfernung an naszierende RNA gebundener Proteine durch Verdau mit RNase wurde eingefuhrt. Dadurch kann die Komplexitat des untersuchten Subproteoms weiter eingeengt werden; zusatzlich werden Hinweise auf eine Funktion der wegfallenden (an RNA gebundenen) Proteine in der Weiterverarbeitung naszierender RNAs gewonnen. Dadurch wurde ein Subproteom mit einer . in Bezug auf Lokalisierung und Funktion der Proteine . an die Fragestellung angepassten Zusammensetzung generiert. Zur Ermittlung und Dokumentation der Leistungsfahigkeit des gesamten Systems wurden zusatzlich radioaktive Markierungen und die immunologische Identifizierung ausgewahlter Spots durch Westernblot-Analysen der 2D-Gele herangezogen. Routinemasig wurde der Zustand direkt vor Reoxygenierung (nach vorausgegangener mehrstundiger Hypoxie) und 1, 2., 5, 10 und 30 Minuten danach untersucht. Die Proteine der extrahierten Kerne wurden durch 2D-Gelelektrophorese (isoelektrische Fokussierung im Bereich zwischen pH 3 und 11 und anschliesende Grosenanalyse im SDS-Gel) aufgetrennt. Nach Silberfarbung der Proteine wurden die Punktmuster ausgewertet, wobei jeder Zustand mindestens funfmal reproduziert wurde (n . 5). Die Proteine aus insgesamt 75 innerhalb der Probenserie signifikant veranderlicher Spots wurden durch massenspektrometrische Analyse identifiziert. Ihre Funktionen . soweit diese bereits publiziert waren . wurden recherchiert und diskutiert. Durch die hohe zeitliche Auflosung konnten oft sogar kinetische Aussagen uber Zeitpunkt, Geschwindigkeit und Dauer der Zustandsveranderungen der identifizierten Proteine gemacht werden.

Die Identifizierung lieferte neben acht hypothetischen Proteinen mit bisher unbekannter Funktion (definiert durch die humane Genomsequenz-Datenbak) sechs mitochondriale und vier ribosomale Proteine. Acht der identifizierten Polypeptide besitzen Aufgaben im Bereich des Cytoskeletts und 17 werden hauptsachlich mit der Transkription und der Prozessierung von RNA in Zusammenhang gebracht. Weitere zwolf sind an der posttranslationalen Modifikation von Proteinen beteiligt, zehn besitzen bekannte Aufgaben bei der DNA-Replikation und -Reparatur sowie der Organisation der Chromatinstruktur. Mindestens zwei Proteine sind an der Bewaltigung von oxidativem Stress beteiligt. 15 weitere Proteine mit Aufgaben bei der DNA-Synthese (Initiation bzw. Elongation), fur die geeignete Antikorper zur Verfugung standen, wurden nach Immunodetektion auf den mit Silber gefarbten Gelen lokalisiert und ausgewertet. Durch den Vergleich ihrer Signale mit den Silberfarbungen konnten die Ergebnisse der Analysen noch zusatzlich gestutzt und auserdem weitere Informationen gewonnen werden. U. a. konnte eine Modifikation (wahrscheinlich eine Acetylierung) von PCNA zeitlich auf wenige Minuten nach der Reoxygenierung eingegrenzt werden. Haufig wurden auch an weiteren der 75 erfassten Proteinspots Hinweise auf posttranslationale Modifizierungen (Phosphorylierung, Acetylierung u. a.) gefunden. Einige besonders interessant erscheinende Beispiele von beobachteten Veranderungen seien hervorgehoben: Eine Form des VCP, das bei oxidativem Stress phosphoryliert wird und fur den proteasomalen Abbau unterschiedlicher Zielproteine benotigt wird, ist unter Hypoxie verstarkt in den extrahierten Kernen zu finden und geht nach Reoxygenierung auf 1/5 zuruck. Ein Spot mit TCP1, das an der Ubiquitinylierung (und damit am Abbau) von HIF1 alpha und anderen Proteinen beteiligt ist, wird nach Reoxygenierung deutlich schwacher. Veranderungen der Mengen von Chromatin- bzw. Matrix-gebundener Proteinphosphatase 1 und mehreren Proteinen, welche die Aktivitat von Proteinkinasen regulieren, geben Hinweise auf Veranderungen im Phosphorylierungsmuster anderer gebundener Proteine im Zuge der Zellantwort auf Reoxygenierung. Die Spots von ANX2 (Annexin A2) und Kin17, die beide unter anderem mit der Initiation der Replikation in Verbindung gebracht werden, nehmen in der Zeit nach dem Aufheben der Hypoxie ebenfalls in charakteristischer Weise ab. Im Hinblick auf die veränderte O2-Konzentration ist sicherlich die Veränderung von Peroxiredoxin 1 ein bemerkenswertes Ergebnis, dessen Menge in den extrahierten Kernen während der ersten 5 Minuten nach Reoxygenierung zu- und anschließend wieder abnimmt. Peroxiredoxin 1 kann aufgrund der vorliegenden Literatur als Sensor für die Konzentration von H2O2 dienen und, indem es in Komplexe mit Chaperon-Funktion integriert wird, evtl. O2-abhängig die dreidimensionale Struktur von Zielproteinen beeinflussen. Sehr interessant ist die Zunahme von gebundenem DDB1 (damaged DNA binding protein 1) nach Reoxygenierung. DDB1 soll nach Literaturangaben das Initiationsprotein CDT1 (= cdc10 target 1; Teil des präreplikativen Komplexes) mit einer Ubiquitinligase in Kontakt bringen, was schließlich zum proteasomalen Abbau von CDT1 führt. Daher könnte die gemessene Veränderung mit der Auslösung der Initiation der DNA-Replikation nach Reoxygenierung in direktem Zusammenhang stehen.

The initiation of cellular DNA replication is reversibly suppressed by hypoxia in a state few minutes before replicon initiation, and reoxygenation triggers the fast release of a burst of replicon initiations followed by a normal S-phase. Trying to identify proteins which are involved in this highly rapid regulation, fast changes of chromatin bound proteins were investigated by proteome analysis methods in the present work. Apart from optimizing existing protocols new methods were established including presynchonization of cells by starving prior to hypoxia or exclusion of proteins bound via nascient RNA by treating chromatin fraction with RNase. The usefulness of these protocols was tested by the proliferation marker PCNA amongst others. 67 different chromatin bound proteins whose amount changed in the chromatin fraction several minutes after reoxygenation of hypoxic cells were identified by 2D-PAGE and mass spectrometry. Apart from some well known proteins involved in DNA repair and replication as well as chromatin structure and organization, several very interesting chromatin bound proteins with various functions were shown to undergo changes after reoxygenation. Some of them are VCP, TCP1, PP1, ANX2, Kin17, PRX1 and DDB1 which are involved in protein folding, degradation and modification or oxidative stress. In addition 15 known initiation and replication proteins, respectively, were investigated by 2D-PAGE and Western blot analysis. First time chromatin bound PCNA was shown to be modified (probably acetylated) at a state few minutes after triggering replicon initiation by reoxygenation of hypoxic cells.