Microarray-based gene expression analysis for the investigation of immunologically relevant processes in tumors

Abstract

Molecularly defined immunotherapies against cancer require the identification of appropriate tumor associated antigens (TAAs). Against this background, patient-individual TAAs for renal cell carcinoma were identified by whole-genome mRNA expression analysis of tumors, autologous normal kidney, and a selection of other normal tissues using oligonucleotide microarrays. These results were applied to HLA ligands simultaneously identified on the patients' tumors in order to define peptide vaccines aiming at the generation of anti-tumor cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses. In addition, gene expression analysis was used to demonstrate that the overall expression profiles of metastases are closely related to the primary tumor. This similarity justifies the approach of TAA identification using resected primary RCC tumors in order to target metastases with the so defined vaccination cocktail. This approach for TAA identification was also applied to colorectal carcinoma, which is a heterogeneous tumor species requiring the careful isolation of tumor cells and corresponding normal epithelial cells in order to obtain tumor cell-specific expression data. Laser microdissection followed by mRNA amplification was employed to generate microarray data and identify candidate TAAs. Impaired RNA quality is a frequent problem in this setting but it could be shown that moderate levels of degradation may still lead to meaningful microarray results. So far, it was unclear whether MHC class II positive tumors are able to directly present peptides of TAAs to CD4+ T helper cells. We could show that autophagy is a process enabling the presentation of MHC-II peptides from intracellular source proteins in general, thereby providing a mechanism for the potential recognition of tumors by CD4+ T cells. These results show how TAAs on MHC-II might arise and illustrates how comprehensive gene expression analysis may contribute to the elucidation of such a fundamental process, which likely has important implications for tumor immunology and cancer immunotherapy.

Jede molekular definierte Immuntherapie gegen Krebs erfordert die Identifizierung geeigneter tumor-assoziierter Antigene (TAAs). Vor diesem Hintergrund wurden patientenindividuelle TAAs beim Nierenzellkarzinom identifiziert. Dazu kam eine genomweite mRNA-Expressionsanalyse von Tumoren, autologem Nierennormalgewebe und einer Auswahl anderer Normalgewebe mittels Oligonukleotid-Microarrays zum Einsatz. Diese Ergebnisse wurden mit HLA-Liganden in Beziehung gesetzt, die zugleich auf Tumoren der Patienten identifiziert wurden, um Peptidvakzine zur Erzeugung einer gegen den Tumor gerichteten Immunantwort durch cytotoxische T-Lymphocyten (CTLs) zu definieren. Zusätzlich wurde mit Hilfe der Genexpressionsanalyse gezeigt, dass die Gesamtexpressionsprofile von Metastasen denen eines Primärtumors sehr ähnlich sind. Diese Ähnlichkeit rechtfertigt die Identifizierung von TAAs auf operativ entfernten Primärtumoren, um mit dem so definierten Vakzin Metastasen anzugreifen. Diese Strategie zur Identifizierung von TAAs wurde auch auf das kolorektale Karzinom angewandt. Es stellt eine heterogene Tumorspezies dar, die eine sorgfältige Isolierung von Tumor- und korrespondierenden normalen Epithelzellen erfordert, um tumorzellspezifische Daten zu ermöglichen. Deshalb wurde ein Verfahren zur lasergestützten Mikrodissektion eingesetzt, um Microarray-Daten zu erhalten und potenzielle TAAs zu identifizieren. In diesem Zusammenhang tritt häufig das Problem auf, dass die gewonnene RNA in ihrer Qualität beeinträchtigt ist. Es konnte aber gezeigt werden, dass ein gewisses Maß an RNA-Abbau immer noch zu aussagekräftigen Microarray-Daten führen kann. Bisher war unklar, ob MHC Klasse II-positive Tumore Peptide von TAAs direkt CD4+ T-Helferzellen präsentieren können. Wir konnten zeigen, dass Autophagie ein Vorgang ist, der die Präsentation von MHC II-Peptiden aus intrazellulären Quellproteinen allgemein ermöglicht. Dies könnte ein Mechanismus für die Erkennung von Tumoren durch CD4+ T-Zellen sein. Diese Ergebnisse zeigen, wie TAAs auf MHC II entstehen könnten und liefern ein Beispiel dafür, wie umfangreiche Genexpressionsanalysen zur Aufklärung solch eines grund-legenden Prozesses beitragen können, der möglicherweise wichtige Auswirkungen für Tumorimmunologie und Krebsimmuntherapie haben könnte.