Mycobacterium tuberculosis adenylyl cyclases Rv2435c and Rv2212c

Abstract

The Mycobacterium tuberculosis genome has 15 open reading frames for class III adenylyl cyclases. Here I report on two structurally different ACs belonging to two different subclasses; the mammalian-like Rv2435c classified as class IIIa, and Rv2212c belonging to class IIIc. Rv2435c is unique in possessing an extracellular domain, two transmembrane helices as a membrane anchor and a C-terminal catalytic domain. Having four deviations from the canonical hexad in the catalytic centre raised theoretical questions concerning AC activity. Three different holoenzyme constructs were expressed and were mostly degraded. Both the catalytic domain and these unstable holoenzymes did not display enzymatic activity. Rv2212c is composed of two distinct protein modules; a C-terminal CHD and an N-terminal regulatory domain, the occurrence of which is restricted to several adenylyl cyclases present in Gram-positive bacteria including the mycobacterial Rv1264. All six amino acids annotated to be participating in catalysis are conserved. The expressed CHD was shown to function as a homodimer. Its specific activity (3.1µmol cAMP mg-1 min-1) and Vmax were high compared to other mycobacterial ACs, whereas substrate affinity was quite low. GC activity was absent. The holoenzyme had a specific activity 4.5-fold lower than the CHD, arguing against the idea of an autoinhibitory N-terminal domain. Also the function of a pH-sensing N-terminal domain was excluded as both CHD and holoenzyme demonstrated a pH-optimum at pH 6.5. Nevertheless the N-terminal domain had a role in dimerization and enzyme stabilization. Unsaturated FAs (arachidonic, oleic and linoleic) caused a significant stimulation of the enzyme by increasing its substrate affinity but without altering Vmax and conferring an increased pH-sensitivity to the protein. The effect of the FAs did not only involve the N-terminal domain because the CHD was similarly affected but to a much lesser extent. In particular, a pH-regulation in presence of FAs was not shown for the CHD, which makes the regulatory role played by the N-terminal domain in presence of FAs more relevant. Deciphering the molecular structure of this protein is required to be able to figure out how the FAs exert these effects and how exactly they interact with the enzyme.

Das Genom von M. tuberculosis enthält 15 Klasse III Adenylatcyclasen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Adenylatcyclasen mit unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften untersucht: die Mammalia-ähnliche Rv2435c aus Klasse IIIa und Rv2212c aus Klasse IIIc. Rv2435c ist die einzige mycobakterielle AC, die aus einer extrazellulären Domäne, zwei transmembranären Helices als Membrananker und einer C-terminalen katalytischen Domäne (CHD) besteht. Sie besitzt vier Abweichungen von den sechs kanonischen Aminosäuren im katalytischen Zentrum, was theoretische Fragen über die AC Aktivität aufgeworfen hat. Drei verschiedene Holoenzym-Konstrukte wurden exprimiert. Allerdings wurden größtenteils Abbruchprodukte gebildet. Sowohl die katalytische Domäne, als auch diese instabilen Holoenzyme zeigten keine enzymatische Aktivität. Rv2212c besteht aus zwei unterschiedlichen Domänen, einer C-terminalen CHD und einer N-terminalen regulatorischen Domäne, die auch in anderen Adenylatcyclasen aus Gram-positiven Bakterien (Rv1264 inbegriffen) gefunden wurde. Alle sechs kanonischen Aminosäuren sind konserviert. Die exprimierte CHD funktioniert als Homodimer. Ihre spezifische Aktivität (3.1µmol cAMP mg-1 min-1) und Vmax waren hoch im Vergleich zu anderen mycobakteriellen Adenylatcyclasen, die Substrataffinität war allerdings gering. GC Aktivität wurde nicht gefunden. Die spezifische Aktiviät des Holoenzyms war 4,5-fach niedriger als die der CHD, was gegen eine mögliche autoinhibitorische Funktion der N-terminalen Domäne spricht. Auch eine Funktion als pH-Sensor kann ausgeschlossen werden, da CHD und Holoenzym ihr pH-Optimum bei pH 6,5 haben. Dennoch spielt die N-terminale Domäne eine Rolle bei der Dimerisierung und der Enzymstabilität. Ungesättigte Fettsäuren (Arachidonsäure, Ölsäure und Linolsäure) stimulierten das Enzym signifikant durch eine Erhöhung der Substrataffinität aber ohne eine Änderung von Vmax und verliehen dem Protein eine hohe pH-Empfindlichkeit. Diese Effekte betreffen allerdings nicht nur die N-terminale Domäne, denn auch die CHD wurde durch die Fettsäuren stimuliert in geringerem Ausmaß. Die Tatsache, dass eine pH-Regulation durch die CHD in Anwesenheit der Fettsäuren nicht beobachtet werden konnten, spricht für die Bedeutung der N-terminalen Domäne bei der Regulation in Gegenwart von Fettsäuren. Durch die Aufklärung der molekularen Struktur des Proteins könnten der Einfluss der Fettsäuren und die Interaktionen mit dem Protein genauer untersucht werden.