Molecular investigations of agonists and antagonists of Toll-like receptors 2 and 4

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dc.contributor.advisor Jung, Günther de_DE
dc.contributor.author Voss, Söhnke de_DE
dc.date.accessioned 2006-01-11 de_DE
dc.date.accessioned 2014-03-18T10:15:11Z
dc.date.available 2006-01-11 de_DE
dc.date.available 2014-03-18T10:15:11Z
dc.date.issued 2005 de_DE
dc.identifier.other 251917010 de_DE
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-21578 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/48869
dc.description.abstract The 55 kDa protein CD14 binds to lipopolysaccharide (LPS) and several other bacterial cell wall components. CD14 plays a central role in TLR2- and TLR4-mediated signaling in the innate immune response. To identify the structural determinants involved in ligand recognition synthetic peptides of 20 amino acids covering the complete CD14 sequence were tested for their potential to neutralize the LPS-dependent induction of IL-8 secretion in human myelomonocytic THP-1 cells. The peptide CD14 (81-100) exhibited a strong neutralizing activity, which was demonstrated to be based on its ability to bind to LPS. A set of aliphatic residues that are highly conserved among CD14 proteins from different species involved in binding of the peptide and the entire protein, as determined by site directed mutagenesis. Circular dichroism spectroscopy showed that the peptide assumed an a-helical secondary structure under mild helix-inducing conditions. Peptides corresponding to the structural determinants of LPS-binding proteins are potential agents for interfering with the initiation of LPS-mediated immunological disorders, such as septic shock. Therefore analogues of the CD14-derived LPS-binding peptide were synthesized with improved solubility and inhibitory activity in cellular assays and in the Limulus amebocyte lysate assay. A novel FRET-based sensing element for detection of lipopolysaccharide was developed. The sensing element is composed of the LPS-binding peptide corresponding to the amino acid sequence 81-100 of human CD14 terminally attached by tetramethylrhodamine (Tamra) and fluorescein residues serving as donor/acceptor pair for fluorescescence resonance energy transfer (FRET). Upon addition of LPS a FRET-based increase of Tamra fluorescence emission upon fluorescein excitation was observed and the ratio of the maximum fluorescence emission of the tetramethylrhodamine and fluorescein was determined for LPS-detection. Discrimination of LPS versus other lipids was achieved by the comparison of the peptide and an analogue with distinct specificity due to alterations in the physicochemical properties using a detailed analysis of the fluorescence emission profile for both molecules. The bioactivity of lipopeptides strongly depends on the dilution protocol. Analysis of fluorescently labeled analogues of the synthetic amphiphilic lipohexapeptide Pam3Cys-Ser-Lys4 by fluorescence correlation spectroscopy revealed that these compounds form aggregates in solution. Dilution into protein-and serum-free buffers leads to a complete loss of activity due to formation of large and highly heterogeneous aggregates. When diluted into BSA or serum-containing buffers, the size of the aggregates was strongly reduced and indicative of an interaction of the lipopeptides with protein. Moreover, the aggregate size depended on the peptide moiety and correlated negatively with the bioactivity of the peptide. Dilution of DMSO stock solutions of lipopeptides with tert.-butyl alcohol/H2O (4:1) prior to the preparation of the final working solutions eliminated these peptide-dependent differences in aggregate size resulting in comparable bioactivities. The lanthionine scaffold has structural similarity with the S-[2,3-dihydroxypropyl]-cysteine core structure of lipopeptides. Therefore, lanthionine-based lipopeptide amides were synthesized and probed for activity as potential TLR2 agonists and antagonists. A collection of analytically defined lipolanthionine peptide amides exhibited an inhibitory effect of the TLR2-mediated IL-8 secretion when applied in high molar excess to the agonistic synthetic lipopeptide Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH. Analysis of structure-activity relationships revealed the influence of the chirality of the two a-carbon-atoms, chain lengths of the attached fatty acids and fatty amines and of the oxidation level of the sulphur atom on the inhibitory activity of the lipolanthionine peptide amides. en
dc.description.abstract CD14 ist ein Rezeptor auf der Zelloberfläche von Makrophagen, der pathogen-assoziierte, molekulare Muster bindet und dadurch eine effiziente Aktivierung des angeborenen Immunsystems ermöglicht. Zur Identifikation funktioneller Domänen aus CD14 wurde die gesamte Sequenz des nativen Proteins durch Peptide mit einer Länge von 20 Aminosäuren abgebildet und deren Einfluss auf die Toll-like Rezeptor-abhängige Zellaktivierung untersucht. Hierbei hemmte das Peptid CD14 (81-100) die LPS-induzierte Sekretion der inflammatorischen Zytokine IL-8 und TNF-a bei einer Konzentration im unteren mikromolaren Bereich. Wie aus Bindungsstudien hervorging, beruht die Aktivität des Peptides auf der Fähigkeit an LPS zu binden. Durch Cirkulardichroismus-Analysen konnte nachgewiesen werden, dass das Peptid unter milden sekundärstruktur-induzierenden Bedingungen eine a-helikale Struktur annimmt. Weiterhin zeigten Untersuchungen der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen sowie Mutagenese-Studien, dass Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten sowohl im Peptid, als auch im Protein für die Bindung an LPS verantwortlich sind. Analoga mit höherer inhibitorischer Aktivität, die als Leitstrukturen für Wirkstoffe zur Prävention und Behandlung von Sepsis und septischem Schock dienen können, wurden durch die Substitution ungeladener und nichtfunktionaler Aminosäuren durch Lysin-Reste, sowie durch die C-terminale Verlängerung des Peptides mit Lysin-Resten generiert. Basierend auf dem oben beschriebenen CD14 Peptid wurde ein FRET-basiertes Sensorelement zur Detektion von LPS entwickelt. Tetramethylrhodamin und Fluoreszein am N- bzw. C-Terminus des Peptides dienten als Donor-Akzeptor-Paar für Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer. In Gegenwart von LPS führte eine Anregung von Fluoreszein zu einer Zunahme der Fluoreszenzemission von Tetramethylrhodamin. Zur Detektion von LPS wurde das Verhältnis der maximalen Fluoreszenzemissionen beider Farbstoffe gebildet. Unter Zuhilfenahme eines zweiten Sensorelements mit unterschiedlicher Spezifität, und der Analyse der Fluoreszenzemissionsprofile beider Sensorelemente wurde eine spezifische Detektion von LPS in einem Konzentrationsbereich von 5 bis 50 µM erreicht. Die agonistische Aktivität von Lipopeptiden ist vom Lösungsprotokoll abhängig. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie konnte dieser Effekt auf ein lösungsmittelabhängiges Aggregationsverhalten dieser lipophilen Substanzen zurückgeführt werden. Durch die Bildung von großen und stark heterogenen Aggregaten führte eine Verdünnung der untersuchten Lipopeptide in BSA- oder serumfreien Puffern zu einem vollständigen Aktivitätsverlust. Dagegen wurde in Gegenwart von BSA oder Serum eine stark verringerte Tendenz zur Bildung von Aggregaten, sowie ein starker Anstieg der Aktivität erreicht. Durch die Verwendung von tert.-Butylalkohol/Wasser als Lösungsmittel konnten sequenzbedingte Aktivitätsunterschiede von Lipopeptiden eliminiert werden. Die Analysen zeigten, dass für die agonistische Aktivität von Lipopeptiden, im Gegensatz zu LPS, eine geringe Aggregatgröße vorteilhaft ist. Lipolanthionin-Peptide inhibieren die TLR2-abhängige Signaltranduktion. Diese inhibitorische Aktivität ist abhängig von der Länge der Fettsäuren und vom Amin-Rest, der Stereokonfiguration sowie der Oxidationsstufe des Schwefels. Ein Analogon mit (2R,6R)-Stereokonfiguration, zwei Myristinsäure-Resten und einem Hexadecylamid-Rest (Myr2LanHda-SK4) zeigte bei einer Konzentration 25 µM eine halbmaximale Inhibition der P3C-SK4 induzierten Zytokinsekretion. de_DE
dc.language.iso en de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podno de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Lipopolysaccharide , Lipopeptide , Sepsis , Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , Antigen CD14 de_DE
dc.subject.ddc 540 de_DE
dc.subject.other CD14 , lipopolysaccharide , lipopeptide , FRET , sepsis en
dc.title Molecular investigations of agonists and antagonists of Toll-like receptors 2 and 4 en
dc.title Molekulare Untersuchungen von Agonisten und Antagonisten der Toll-like Rezeptoren 2 und 4 de_DE
dc.type PhDThesis de_DE
dc.date.updated 2006-02-03 de_DE
dcterms.dateAccepted 2005-12-20 de_DE
utue.publikation.fachbereich Sonstige - Chemie und Pharmazie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
dcterms.DCMIType Text de_DE
utue.publikation.typ doctoralThesis de_DE
utue.opus.id 2157 de_DE
thesis.grantor 14 Fakultät für Chemie und Pharmazie de_DE

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