Cathepsin D : design and characterisation of new in vitro and in vivo substrates applied to biological samples

Abstract

The specific and sensitive detection of protease activities within aqueous biological fluids such as blood, urine, sweat or cell lysates is important since proteases are widely used biomarkers for the discrimination between diseased and healthy samples. Recently, great efforts have been made to develop new proteomic approaches implying screening studies for the parallel determination of various parameters. Therefore specific and high-throughput compatible methods are required. The present work describes a new method for the determination of CatD activity which is generally applicable on peptide substrates and represents a useful tool and complements established enzyme assays. The applicability of the digest & pull down assay was applied to biological samples such as cell lysates and sweat. As a result thereof, CatD was detected in human eccrine sweat. Furthermore, we could show that CatD, in combination with at least two other proteases, is involved in the postsecretory processing of the antimicrobial peptide DCD-1L into 12 DCD-1L derived peptides from which at least one (SSL-25) shows an higher activity than DCD-1L. Thus postsecretory processing by CatD modulates the innate immune defense of human skin by generating a bigger set of DCD-1L derived peptides with different antimicrobial activities. Recently, fluorescence based visualization techniques such as confocal laser scanning microscopy (CLSM) and fluorescence associated cell sorting (FACS) more and more became the methods of choice for cellular investigations. So it is highly desirable to develop innovative fluorescent probes which are compatible to these bioanalytical methods. Since protease activities commonly can only be detected in cell lysates a new cell permeable peptide substrate was designed for the visualization of protease activity within living cells. The developed R9-CatD-substrate consists of the cell-penetrating peptide R9 and the specific CatD-substrate. The scissile bond is flanked by TAMRA and carboxyfluorescein respectively. Upon cleavage with CatD the quenching of the fluorophores is abolished and both the TAMRA and the carboxyfluorescein fluorescence can be measured. Once in the endolysosomal pathway the R9-substrate is cleaved and the fluorescence increases as can be determined by CLSM and FACS analysis. The presented design of cell-penetrating, doubly-labeled peptide substrates and their application for cellular investigations is an innovative and promising approach which reasonably endorses other common techniques such as in vitro digestion experiments or western blot analysis. As already mentionend above, a vast number of applications in bioanalytical chemistry depend on fluorescein labeled molecules. Fluorescein derivatives have evolved to widely used reagents for the preparation of hydrolytically stable fluorescent peptide and protein conjugates. However, the strong pH dependence of the fluorophore narrows its applicability especially in acidic buffer systems such as it is the case for commonly used RP-HPLC systems. Therefore a new RP-HPLC method was developed yielding a 40-fold signal increase without loss of reproducibility or peak resolution. This method has been used for the quantification of cellular uptake of the fluorescent labeled cell-penetrating peptide penetratin by human EBV-transformed B cells. Taken together, a new method for the determination of CatD activity based on biotinylated and fluorescent peptide substrates was developed and applied to various biological samples particularly to human eccrine sweat, where CatD could be detected for the first time. In this context the physiological function of CatD in human eccrine sweat was investigated stating its involvement in the postsecretory processing of the antimicrobial peptide DCD-1L and therefore its role in the modulation of the immune defense of human skin. Moreover the designed CatD substrate was modified by making it cell permeable and by the introduction of two fluorophores so that it can be used as an activity-based probe for the intracellular localisation and quantification of CatD activity within living cells. In general, the cellular uptake of fluorescein-labelled cell-penetrating peptides by human EBV-transformed B cells was quantified by a new RP-HPLC based method.

Der spezifische und empfindliche Nachweis von Proteaseaktivitäten in wässrigen biologischen Proben wie Blut, Urin, Schweiß oder Zelllysaten ist wichtig, da Proteasen häufig als Biomarker verwendet werden um zwischen Proben von Kranken und Gesunden zu unterscheiden. In den letzten Jahren wurden neue Proteomics-Anwendungen entwickelt um in einem Ansatz parallel mehrere Parameter zu detektieren. Aufgrund dieser Tatsache werden spezifische Methoden, die sich zur Automatisierung eignen benötigt. In der vorliegenden Arbeit wird eine neue Methode zum Nachweis der CatD Aktivität vorgestellt, die sich prinzipiell auch auf beliebige andere Peptidsubstrate übertragen lässt und deshalb eine sinnvolle Ergänzung zu den bisher bekannten Enzymaktivitätstests darstellt. Der entwickelte Digest & Pull Down Assay wurde zur Bestimmung der CatD-Aktivität in biologischen Proben wie Zelllysaten und Schweiß verwendet. CatD konnte so in menschlichem Schweiß nachgewiesen werden. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass CatD in Verbindung mit noch mindestens zwei weiteren Proteasen für die postsekretorische Prozessierung des antimikrobiellen Peptids DCD-1L in 12 DCD-1L abgeleitete Peptide verantwortlich ist, von denen mindestens ein Peptid (SSL-25) eine höhere antimikrobielle Aktivität besitzt als DCD-1L. Die angeborene Immunabwehr der Haut wird durch postsekretorische Prozessierung mittels CatD moduliert, indem 12 DCD-1L abgeleitete Peptide generiert werden, die unterschiedliche antimikrobielle Aktivitäten besitzen. Die fluoreszenzbasierenden Visualisierungstechniken konfokale Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM) und Durchflusszytometrie (FACS) entwickelten sich in den letzten Jahren immer mehr zur bevorzugten Methode für zelluläre Untersuchungen. Die Entwicklung innovativer fluoreszierender Substanzen für diese Anwendungen ist deshalb von größter Bedeutung. Da Proteaseaktivitäten üblicherweise nur in Zelllysaten detektierbar sind, wurde ein neues zellgängiges Peptidsubstrat konstruiert, um Proteaseaktivitäten auch in lebende Zellen nachweisbar und sichtbar zu machen. Das R9-Substrat setzt sich aus dem zellgängigen Peptid R9 und dem spezifischen CatD-Substrat zusammen. An die zu spaltende Bindung grenzen die Fluorophore TAMRA und Carboxyfluorescein. Nach der Spaltung durch CatD ist der Quenching-Effekt der beiden Fluorophore aufgehoben und sowohl die TAMRA- als auch die Fluorescein-Fluoreszenz kann detektiert werden. In endolysosomalen Kompartimenten wird das R9-Substrat unter Zunahme des Fluoreszenzsignales gespalten und kann durch konfokale Laser-Raster-Mikroskopie oder durchflußzytometrisch nachgewiesen werden. Das vorgestellte Prinzip der zellpermeablen, doppelt markierten Peptidsubstrate und ihre Anwendung für zelluläre Untersuchungen ist ein innovativer und viel versprechender Ansatz, der eine sinnvolle Ergänzung zu herkömmlichen Techniken wie in vitro Verdauexperimente oder Western Blot Analysen bietet. Wie bereits oben erwähnt, basieren viele bioanalytische Anwendungen auf Fluoreszenz-markierten Substanzen. Besonders die hydrolytisch stabilen, mit Fluorescein gekoppelten Peptide und Proteine finden eine breite Anwendung. Jedoch verringert die starke pH-Abhängigkeit von Fluorescein dessen Anwendung vor allem in sauren Puffersystemen, wie sie zum Beispiel bei gängigen RP-HPLC-Systemen verwendet werden. Dieses Problem wurde durch die Entwicklung einer neuen RP-HPLC-Methode gelöst, die um den Faktor 40 sensitiver ist als herkömmliche Systeme und mit der gleichen Reproduzierbarkeit und Peak-Auflösung arbeitet. Mit dieser Methode wurde die Aufnahme des zellgängigen Peptids Penetratin von humanen EBV-transformierten B-Zellen quantifiziert. Eine neue Methode zum Nachweis von CatD Aktivität basierend auf biotinylierten und fluoreszierenden Peptidsubstraten wurde entwickelt und auf verschiedene biologische Proben angewendet, insbesondere auf Schweiß, wo CatD zum ersten Mal nachgewiesen wurde. In diesem Zusammenhang wurde die physiologische Funktion von CatD im Schweiß gezeigt. CatD ist an der postsekretorischen Prozessierung des antimikrobiellen Peptids DCD-1L beteiligt und dadurch an der Modulation der Immunabwehr der Haut. Des weiteren wurde das konstruierte CatD-Substrat zellgängig und durch die Kopplung mit zwei Fluorophoren nachweisbar gemacht und kann so zur intrazellulären Lokalisation von CatD-Aktivität verwendet werden. Die Internalisierung von fluoreszenzmarkierten, zellgängigen Peptiden von humanen EBV-transformierten B-Zellen im allgemeinen wurde durch eine neu entwickelte RP-HPLC-Methode quantifiziert.