Rolle der Prostaglandinproduktion in afrikanischen Trypanosomen: Charakterisierung des Effektes von Prostaglandin D2 und seiner Metabolite auf die Blutform von Trypanosoma brucei

DSpace Repository


Dateien:
Aufrufstatistik

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-20851
http://hdl.handle.net/10900/48853
Dokumentart: Dissertation
Date: 2005
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Duszenko, Michael
Day of Oral Examination: 2005-11-23
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Prostaglandin D2 , Apoptosis
Other Keywords: Apoptose , Programmierter Zelltod , Reaktive Sauerstoffspecies
prostaglandin , apoptosis , programmed cell death , diferentiation , reactive oxygen species
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

In dieser Arbeit wurde der Effekt der Prostaglandine auf die Blutform von Trypanosoma brucei untersucht. Die Behandlung der Trypanosomen mit PGD2 (aber nicht mit PGE2 und PGF2a) führte zu einer signifikanten Hemmung des Zellwachstums und der DNA Synthese. Die halbinhibitorische Konzentration (IC50) von Prostaglandin D2 nach 24 h Inkubation betrug 3,7 µM. Allerdings war die effektive Konzentration viel niedriger, da diese Verbindung einen hydrophoben Charakter besitzt und deswegen an das Albumin bindet. Nach 1 h Inkubation blieb nur etwa 20% freies PGD2 übrig. Bei der Auslösung der Proliferationsinhibition waren PGE2 und PGF2a etwa 43 bzw. 54 Mal schwächer als PGD2. Die Behandlung von Trypanosomen mit diesen Prostaglandinen induzierte bei Konzentrationen bis 5 µM sogar eine Erhöhung der DNA Synthese um etwa 20%, so dass man vermuten könnte, dass PGE2 und PGF2a eine Rolle bei der Proliferation spielen. Durch Beobachtung morphologischer Veränderungen und die Anwendung spezifischer Färbungen konnte gezeigt werden, dass Prostaglandin D2 zum Zelltod der Blutform dieses Parasiten führt. Autophagie wurde dabei als Zelltod- Mechanismus durch Verwendung von Monodansylcadaverin und spezifischen Inhibitoren ausgeschlossen. Zudem zeigte der PGD2-induzierte Zelltod ähnliche Charakteristika wie die Apoptose, war jedoch Caspase-unabhängig, da die Trypanosomen über keine Caspase verfügen und Caspase-Inhibitoren den Effekt nicht aufheben konnten. PGD2 ist als ein sehr instabiles Molekül bekannt. Deshalb wurde seine Metabolisierung unter den verwendeten experimentellen Bedingungen untersucht. Die Umwandlung von PGD2 erwies sich als ein sehr schneller Prozess, da mehr als 80% des eingesetzten PGD2 bereits nach 12 h Inkubation metabolisiert war. Nach 20 h und 40 h Inkubation wurden die Metabolite der D-Serie (15d-PGD2 und 15k-PGD2) und der J-Serie (15d-PGJ2, D12PGJ2 und PGJ2) im Medium identifiziert. Die Metabolite der D-Serie induzierten keine Veränderungen in den Trypanosomen. Im Gegensatz dazu riefen die Derivate der J-Serie eine starke Inhibierung der Proliferation hervor. Sie induzierten morphologische Veränderungen, einen Zellzyklusarrest, Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, DNA Degradation und die Exposition von Phosphatidylserin schneller, effektiver und bei niedrigeren Konzentrationen als PGD2. Allerdings konnte festgestellt werden, dass PGD2 selbst auch einen Effekt auf die Trypanosomen ausübt, da das stabile synthetische Analogon 17-phenyl-PGD2 den gleiche Phänotyp wie PGD2 induzierte. Physiologisch betrachtet ist jedoch die Metabolisierung von PGD2 von großer Bedeutung für die Verstärkung der Zelltodinduktion. Der Effekt von Prostaglandin D2 und den Metaboliten der J-Serie war stark von der Wachstumsphase der Parasiten abhängig. Trypanosomen aus der stationären Phase waren empfindlicher als die Trypanosomen aus der logarithmischen Phase. Behandlung von monomorphen Trypanosomen mit Br-cAMP, das die Differenzierung von der slender zur stumpy Form induziert, erhöhte ebenfalls die Empfindlichkeit der Trypanosomen gegenüber diesen Prostaglandinen. Zusätzlich wirkte PGD2 auch stärker auf stumpy als auf slender Trypanosomen, wenn diese bei Verwendung eines pleomorphen Stammes aus der Maus isoliert wurden. Das deutet ebenfalls darauf hin, dass diese Prostaglandine vor allem auf die stumpy Form des Parasiten wirken. Da Prostaglandine als starke Induktoren des intrazellulären oxidativen Stress beschrieben wurden, wurde die Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) am Prozess des induzierten Zelltods untersucht. Dazu wurden zwei ROS scavenger, N-Acetyl-L-Cysteine (NAC) und Glutathion, eingesetzt, die den induzierte Zelltod verhinderten und das Überleben der Parasiten signifikant verlängerten. Mittels Dichlorodihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) konnte dann auch direkt bestimmt werden, dass die Prostaglandine der J-Serie die Bildung von intrazellulärem ROS verursachten. Vorinkubation mit NAC oder Glutathion verhinderte die ROS Generation und somit den Zelltod. Die Produktion von ROS wurde ebenso durch Vorinkubation mit Cycloheximid gehemmt, was darauf hindeutet, dass der induzierte Prozess ein aktives Ereignis ist, das eine de novo Proteinbiosynthese erfordert. Die hier erzielten Ergebnisse sprechen für einen stumpy Form-spezifischen induzierten Zelltodprozess, der als Apoptosis-like PCD bezeichnet wird und durch Bildung von Sauerstoffradikalen hervorgerufen wird. Aufgrund dieser Ergebnisse schlagen wir vor, dass die Sekretion von PGD2 aus den Parasiten und seine Umwandlung in Derivate der J-Serie als ein Mechanismus zur Regulierung der Zelldichte im Wirt dienen könnte und somit eine wichtige physiologische Funktion besitzt. Die hier vorgestellten Untersuchungen öffnen neue Türen für die Aufklärung der PCD-Maschinerie in Trypanosoma brucei und liefern somit unter Umständen neue Targetmoleküle für die Behandlung der Schlafkrankheit.

Abstract:

African trypanosomes cause sleeping sickness in humans and severe epidemics in livestock. Due to antigenic variation, the course of infection is characterized by parasitic waves, which peak every 8 to 10 days; untreated, the infection is lethal. Although the decline of parasite density is contributed to the appearance of specific antibodies, immunosuppressed animals also show a regular increase and decrease in parasite numbers and this behavior is even observed in vitro, if culture media are replaced at regular intervals. Thus, beside the control of parasitaemia by the immune system of the host, cell density is also regulated by the parasite itself. Following up reports about an increase of prostaglandin levels in serum and the cerebrospinal fluid of sleeping sickness patients [10], we have shown that trypanosomes produce PGD2, PGE2 and PGF2a from arachidonic acid. These prostaglandins led to a broad variety of different physiological effects in higher eukaryotes and their accumulation in serum coincides remarkably with symptoms observed during trypanosomiasis, such as fever, pain, immunosuppression, dysregulation of sleep/wake cycles and others. So far it is not clear why protozoa produce PGs, but it is tempting to speculate that these parasites may have adopted the formation of PGs to modify host reactions for their own benefit. In addition, we also found that PGF2a was mainly produced in fast dividing forms of the parasite such as the slender bloodstream form and the procyclic insect form and was scarcely secreted into the media, while PGD2 was mainly produced by the non dividing stumpy bloodstream form and was primarily secreted. Here we report the effect of prostaglandin D2 on cellular growth of Trypanosoma brucei bloodstream form under in vitro culture conditions. As judged from our results, PGD2 (but not PGE2 and PGF2a) induces a programmed cell death with characteristic features of apoptosis, including maintenance of plasma membrane integrity, phosphatidylserine exposure, loss of mitochondrial membrane potential, nuclear chromatin condensation, and DNA degradation. Due to the lack of caspases in protozoa, the classical apoptosis mechanism cannot work in single cell organisms. However, published data indicate that apoptosis can occur in the complete absence of caspases. Additionally, a considerable number of investigations have been reported, showing that at least some of typical programmed cell death features like DNA fragmentation, autophagy, exposition of phosphatidylserine, decrease of mitochondrial membrane potential etc. can be observed in protozoa like Leishmania, T. cruzi, T. brucei, Tetrahymena, Blastocystis, Dictyostelium, yeast and even in bacteria. Since PGD2 is readily metabolized in the presence of albumin, we were prompted to investigate if their metabolites rather than PGD2 itself are responsible for the observed PCD. Using LC-ESI/MS, we identified various metabolites of the D and J series. The latter derivatives, especially PGJ2 and D12PGJ2, were able to induce PCD more efficiently than PGD2. However, the stable PGD2 analog 17-phenyl trinor PGD2 led to the same phenotype as the natural PGD2, indicating that the latter induces PCD as well. Interestingly, the intracellular ROS level increased significantly under J series metabolites treatment and incubation with N-acetyl-L-cysteine or glutathione reduced ROS production and cell death significantly. In conclusion, we propose that the induction of cell death by PGD2 and J series derivatives in bloodstream form trypanosomes could be involved in cell density regulation.

This item appears in the following Collection(s)