Funktionelle Charakterisierung von Hitzeschockfaktoren aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

Abstract

Die Hitzeschockfaktoren (HSF) eukaryotischer Organismen sind konservierte Transkriptionsfaktoren mit starken Homologien innerhalb der DNA-Bindungsdomäne. Unter physiologischen Stressbedingungen binden HSF in oligomerer Form an Hitzeschockelemente (HSE) innerhalb der Promotoren von HS-Genen und induzieren deren transiente Transkription. Erhöhte Titer an HS-Genprodukten schützen vor akuten Zellschäden und führen zum Erwerb höherer Stresstoleranz. Neben dieser Rolle als zentrale Regulatoren der HS-Reaktion wurden für einzelne Vertreter der HSF-Familie zellstadium- und entwicklungsspezifische Funktionen nachgewiesen. Auf die Expression ihrer Zielgene, bei denen es sich nicht ausschließlich um klassische HS-Gene wie Hitzeschockproteine handelt, üben HSF in einigen Fällen auch negativ-regulatorische Eigenschaften aus. Das Genom von Arabidopsis thaliana enthält die für Pflanzen typische, große Anzahl von 21 HSF-Homologen. Sechs von ihnen waren Gegenstand dieser Arbeit. Aufgrund struktureller Besonderheiten innerhalb ihrer Aminosäuresequenz gehören jeweils drei der Klasse-A und drei der Klasse-B an. Im Einzelnen handelte es sich um HSF1 (AtHsfA1a), HSF2 (AtHsfA1e), HSF3 (AtHsfA1b) und HSF4 (AtHsfB1), HSF6 (AtHsfB2a), HSF7 (AtHsfB2b); wobei die Angaben in Klammern der von Nover et al. (2001) vorgeschlagenen Nomenklatur entsprechen. Die funktionelle Charakterisierung dieser HSF umfasste deren Expressionsanalyse, den Nachweis ihrer HSE-Bindungsaktivität, loss-of-function- und im Einzelfall gain-of-function-Ansätze und wurde im Hinblick auf eine mögliche Beteiligung an der HS-Reaktion durchgeführt. Aufgrund der nachgewiesenen Expression in vegetativem Arabidopsis-Gewebe können alle 6 HSF an der HS-Reaktion beteiligt sein. Die in E. coli rekombinant exprimierten HSF haben in homooligomerer Form an synthetische HSE gebunden, womit sie ein wesentliches HSF-Merkmal erfüllt haben. Mit Hilfe eines neu entwickelten Immunpräzipitationsassays konnte eine Hitzeinduktion der HSE-Bindungsaktivitäten von HSF1 und -3 in Arabidopsis-Blättern nachgewiesen werden. Außerdem wurde mit dieser Methode der vollständige Verlust der HSE-Bindungsaktivität von HSF1 und HSF3 in den im Rahmen dieser Arbeit isolierten T-DNA-Insertionslinien hsf1-tt1 und hsf3-tt1 gezeigt. Die HSE-Bindungsaktivitäten von HSF2, HSF4, HSF6 und HSF7 konnten in Arabidopsis-Blättern vor und während eines 2-stündigen HS nicht nachgewiesen werden. In wie weit das ein Hinweis dafür ist, dass diese HSF nicht an der HS-Reaktion beteiligt sind, wird diskutiert. Mittels Durchmustern von T-DNA-Insertionslinien wurden knockout-Mutanten für HSF1, HSF3 und HSF7 isoliert. Die phänotypisch unauffälligen Mutanten zeigten auch auf molekularer Ebene keine Unterschiede zum WT bezüglich der HS-Genexpression, weshalb für diese HSF entweder redundante oder für das normale Wachstum und die HS-Reaktion entbehrliche Funktionen angenommen werden müssen. Die Doppelmutante hsf1/hsf3, welche durch Kreuzen der beiden Einzelmutanten generiert worden war, zeigte keine veränderte Thermotoleranz. Analysen zur HS-Genexpression ergaben aber, dass HSF1 und HSF3 synergistisch zusammenwirken und für die Akkumulation großer Mengen von hitzeinduzierten Transkripten in der Frühphase der HS-Reaktion verantwortlich sind. Anhand der hsf1/hsf3-Doppelmutante konnte außerdem gezeigt werden, dass die hitzeinduzierte Expression von HSF4 und HSF7 abhängig von HSF1 und HSF3 ist. Darüberhinaus ergab die strukturelle und funktionelle Analyse des HSF7-Promotors, dass HSF7 ein direktes Zielgen von HSF darstellt. Somit wurde erstmals die direkte Regulation der Expression eines HSF durch andere HSF gezeigt. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zu HSF4, HSF6 und HSF7 lassen keine eindeutige Aussage über ihre Funktion im Speziellen oder die Funktion von Klasse-B-HSF im Allgemeinen zu. Während der HSF7-knockout ohne nachweisbare Auswirkungen blieb, hatte die ektopische Expression von HSF7-Konstrukten schwerwiegende, pleiotrope Effekte auf die transgenen Arabidopsis-Pflanzen. [Teile dieser Arbeit wurden zwischenzeitlich in Zhang et al. (2003) und Lohmann et al. (2004) veröffentlicht.]

Heat shock factors (HSF) of eucaryots are conserved transcription factors having strong homologies within their DNA-binding domains. Cellular stress leads to a binding of oligomerized HSF to heat shock elements (HSE) within the promoters of heat shock genes and induces their expression. Accumulation of heat shock proteins (HSP) preserves cells of acute damages and will lead to acquired stress tolerance. Beside that central role as regulators of the heat shock response additional functions in distinct cellular stages and during development have been observed for several members of the HSF family. In some cases HSF target gene expression is negatively regulated by HSF. Comparable to other plants the genome of Arabidopsis thaliana is containing the high number of 21 HSF homologues out of which 6 have been topic of this thesis. Because of several structural features of their amino acid sequence 3 of them are assigned to class A HSF while the remaining 3 are members of class B HSF. In detail the following HSF have been examined: HSF1 (AtHsfA1a), HSF2 (AtHsfA1e), HSF3 (AtHsfA1b) and HSF4 (AtHsfB1), HSF6 (AtHsfB2a), HSF7 (AtHsfB2b). Names given in brackets are according to the nomenclature proposed by Nover et al. (2001). Functional characterisation of those HSF included expression analysis, HSE-binding capability, loss of function and in single cases gain of function approaches, generally focusing on their potential to participate in heat shock response. Each HSF analysed turned out to be expressed in vegetative tissues of Arabidopsis. After expression in E. coli recombinant HSF showed strong binding to HSE, thereby meeting a major trait of HSF. By applying a newly developed immunoprecipitation (IP) assay heat induced HSE-binding activity of HSF1 and HSF3 was observed in leaves of Arabidopsis. In addition, usage of the IP assay was able to prove the complete loss of HSE-binding activity of HSF1 and HSF3 in T-DNA insertion lines hsf1-tt1 and hsf3-tt1. In contrast HSE-binding activities of neither HSF2, HSF4 nor HSF6 could be observed in Arabidopsis leaves before, during and after a shock of 2 h. Based on that finding it is discussed wether those HSF might indeed not paticipate in heat shock response but might fulfill different functions. By screening T-DNA insertion lines knockout mutants for HSF1, HSF3 and HSF7 were isolated. In comparison to wildtype plants mutants neither showed any phenotypical alterations nor changes in heat shock gene expression. Therefore redundant functions of those HSF are assumed, at least functions which are dispensable during normal growth and HS response. HSF1 and HSF3 double knockouts derived by crossing hsf1-tt1 and hsf3-tt1 did not show changes in aquired thermotolerance. However , profiling of heat induced gene expression revealed that HSF1 and HSF3 are synergistically acting as activators of heat shock gene expression in early stages of HS response. Using the hsf1/hsf3 double knockout plants it was shown that heat inducible expression of HSF4 and HSF7 is dependant on HSF1 and HSF3. In addition structural and functional analysis of HSF7 promoter identified HSF7 to be a direct HSF target gene. Results obtained on HSF4, HSF6 and HSF7 were not capable to answer questions on their specific function nor on the general function of class B HSF. While knockout of HSF7 had no visible effects ectopic expression of HSF7 lead to strong pleiotropic phenotypic alterations which are not yet understood. [Several parts of this thesis have been published in Zhang et al. (2003) and Lohmann et al. (2004) meanwhile.]