Der Einfluss von Aminopeptidasen auf die Antigenprozessierung

Abstract

In den letzten Jahren wurden immer mehr Kenntnisse über den MHC-Klasse I-Antigenprozessierungsweg gesammelt und viele Einzelheiten im Detail untersucht. Damit ist es nun nicht nur möglich die einzelnen Schritte nachzuverfolgen, sondern auch einige von ihnen vorherzusagen. Die großen Unbekannten bei der Klasse I-Prozessierung sind jedoch immer noch die Aminopeptidasen, die im Cytosol wie auch im ER das Epitop schließlich auf die endgültige Größe trimmen können. Dabei wird auch der N-Terminus des Epitops generiert und ließe sich somit zu einem gewissen Prozentsatz über die Spezifität der Peptidasen beschreiben. Im Laufe dieser Arbeit sollten die Aminopeptidasen und damit auch die Generierung des Epitop-N-Terminus untersucht und damit die letzte große Lücke bei der MHC-Klasse I-Antigenprozessierung geschlossen werden.

Im ersten Teil des Projekts wurde dabei die Breitspektrenanalyse, eine Kombination von biostatistischer und biochemischer Analyse verwendet, um die allgemeinen Vorgänge bei der Prozessierung des N-Terminus zu untersuchen und der Einfluss von cytosolischen und endoplasmatischen Aminopeptidasen auf dessen Generierung nachzuweisen. Da keinerlei Daten zur cytosolischen und endoplasmatischen Aminopeptidaseaktivität existierten, wurden diese zuerst durch Aufreinigung der jeweiligen Kompartimente und anschließendem Umsatz eines Satzes bestehend aus allen 20 fluorogenen Ein-Aminosäure-AMC-Substraten gewonnen. Die bestehenden Daten über das Proteasom und TAP und die neu generierten über cytosolische und endoplasmatische Aminopeptidasen konnten nun mit den Aminosäuren N-terminal von um die 900 Epitopen aus der SYFPEITHI-Datenbank verglichen werden. Schon bei der Untersuchung möglicher Epitopvorläufer hat sich gezeigt, dass in einer ungefähr 7 Aminosäure-langen Sequenz upstream des N-Terminus von Epitopen die Aminosäuren nicht zufällig vorkommen, sondern es gewisse Bevorzugungen gibt. Diese Sequenz soll nun als N-terminales Prozessierungsmotiv bezeichnet werden. Bei dem Vergleich mit der Proteasom- und TAP-Spezifität stellte sich heraus, dass innerhalb dieses Motivs nicht nur präferenziell geschnitten, sondern auch diese Vorläufer bevorzugt transportiert werden. Bei einem genauen Vergleich zeigt sich jedoch, dass es auch Aminosäurebevorzugungen an bestimmten Positionen gibt, die sich nicht durch das Proteasom oder TAP begründen lassen. Diese jedoch lassen sich erklären, wenn man die Spezifitäten der Aminopeptidasen in Betracht zieht. Bei diesem Vergleich stellt sich heraus, dass die letzten beiden Aminosäuren direkt vor dem N-Terminus eines Epitops eine deutliche Bevorzugung für ein Trimming durch endoplasmatische Aminopeptidasen zeigen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die letzten beiden Positionen vieler MHC-Klasse I-Liganden-Vorläufer im ER durch Aminopeptidasen geschnitten werden.

Während im ersten Teil dieser Arbeit nun die allgemeinen Prozessierungsvorgänge, insbesondere im Hinblick auf Aminopeptidasen, untersucht wurden, sollte im zweiten Teil die Gesamtaminopeptidaseaktivität in ihre Einzelteile zerlegt und diese im Detail analysiert werden. Dazu wurde Cytosol zuerst aufgereinigt und dann mittels verschiedenster chromatographischer Techniken aufgetrennt. Die Fraktion mit der jeweils relevanten Aktivität wurde danach einer SDS-PAGE unterzogen und dann über MALDI/Tandem MS identifiziert. Die entsprechenden Aminopeptidaseaktivitäten wurden zum einen über Tests mit allen 20 Ein-Aminosäure-Substraten und zum anderen durch verschiedene Inhibitoren bestimmt. Dabei hat sich herausgestellt, dass es im Cytosol drei Hauptaktivitäten und zwei Nebenaktivitäten gibt. Zu den drei wichtigsten Aminopeptidasen zählen die Puromycin-sensitive Aminopeptidase (PSA) und die Bleomycin-Hydrolase (BH), die zusammen schon einen Großteil abdecken. Die dritte Aminopeptidase ist die Aminopeptidase B (AP B), die fast exklusiv für Lysin, Arginin und Prolin zuständig ist. Die zwei kleineren cytosolischen Aktivitäten sind die Leukotrien A-4 Hydrolase (LTA4H) und eine Aspartat-abbauende Aminopeptidase, bei der es sich um die Aspartyl Aminopeptidase handeln könnte. Um nun den Einfluss in vivo untersuchen zu können, wurden die als spezifisch im Sinne ihrer Verwendung getesteten Inhibitoren Puromycin für PSA, E64 für BH, Arphamenin A für AP B und Captopril für LTA4H auf ihre Membrangängigkeit hin analysiert. Da hierbei nur E64 positiv war, muss für weitere Versuche auf das siRNA-System ausgewichen werden. Damit sollte es möglich sein, den Einfluss dieser fünf Proteasen auf die Prozessierung von verschiedenen Epitopen in der Zelle selbst zu bestimmen. Mit diesem Wissen ließe sich das Bild der MHC-Klasse I-Antigenprozessierung komplettieren. Damit wäre es auch möglich, die Entstehung des N-Terminus von Epitopen individuell vorhersagen zu können, ein Aspekt der für die Immunisierung und Krankheitsbehandlung gleichermaßen von Interesse wäre.

In the last years an increase of knowledge was collected about the MHC class I antigen processing pathway and many details were analysed. This made it possible to not only follow every single processing step, but also to predict some of them. The big enigma in class I processing are still the aminopeptidases in the cytosol and ER that have the ability to trim the epitope to its final size, thereby generating the epitope N-terminus. Consequently, this process could be described to a certain percentage by the specificity of these peptidases. In the course of this work the aminopepidases and the subsequent generation of the epitope N-terminus should be analysed so that the last big gap in the MHC class I antigen processing pathway can be closed.

In the first part of this project broad spectrum analysis was used, consisting of a combination of biostatistical and biochemical analysis, to examine the general processes during the creation of the N-terminus and to prove the influence of cytosolic and endoplasmic aminopeptidases on its generation. Due to the fact that there was no data about the cytosolic and endoplasmic aminopeptidase activities, it had to be generated first. This was done by purifying each compartment followed by measuring the turnover of a complete set of all 20 fluorogenic one-amino acid-AMC-substrates. The existing data of the proteasome and TAP and the newly generated one of cytosolic and endoplasmic aminopeptidases could now be compared with the amino acids N-terminal of about 900 epitopes from the SYFPEITHI database. The analysis of possible epitope precursors already showed that there is a sequence of approximately 7 amino acids upstream the N-terminus of epitopes in which the amino acid distribution is not random but shows a certain preference. This sequence shall now be called the N-terminal processing motif. The comparison with the proteasome- and TAP-specificity revealed that there is not only preferential cleavage within this motif but also that the resulting precursors are favoured for transport into the ER. A closer look showed however that there is also amino acid preferences at certain positions which can not be explained by the specificity of the proteasome or TAP. These differences however, can be resolved if the specificities of aminopeptidases are taken into account. Comparing these with the processing motif shows that the last two amino acids right before the N-terminus of an epitope are clearly preferred by endoplasmic aminopeptidases. This observation leads to the conclusion that the last two positions of many MHC class I ligand precursors are cleaved off by endoplasmic aminopeptidases.

In the first part of this project, the general processing events especially concerning the steps involving aminopeptidases were analysed. In the second part the overall aminopeptidase activity should now be divided into single activities followed by further analysis. For that purpose, cytosol was first purified and then fractionated by different chromatographic methods. The final fractions with the relevant activities were further seperated by SDS-PAGE and after visualisation and tryptic in-gel digestion identified by MALDI/Tandem MS. The resulting aminopeptidases were further characterised with the help of a complete set of 20 single residue substrates and specific inhibitors. This approach led to the conclusion that there are three major and two minor activities in the cytosol. Puromycin-sensitive aminopeptidase (PSA) and bleomycin hydrolase (BH) belong to the more important activities and together they already cover a major part of the overall cytosolic activity. The third major aminopeptidase could be identified as aminopeptidase b (AP B), which is almost exclusively responsible for the cleavage of lysine, arginine and proline. The two minor activities are leukotriene A-4 hydrolase (LTA4H) and an aspartate-cleaving aminopeptidase, which could be aspartyl aminopeptidase. To be able to examine the influence in vivo, the specific (in this experimental setup) inhibitors puromycin for PSA, E64 for BH, arphamenine a for AP B and captopril for LTA4H were tested on their ability to permeate the cell membrane. Due to the fact that only E64 showed a positive result, further experiments in this direction have to be based on the usage of siRNAs. With their help it should be possible to evaluate the influence of all five proteases on the processing of different epitopes in the cell itself. With this knowledge it is possible to complete the picture of the MHC class I antigen processing. Moreover, this would make it possible to predict the generation of the N-terminus of individual epitopes, which would be of great interest for future vaccinations and the treatment of diseases.