Kombinatorische SPOT-Synthese neuer S-Glycopeptide als Oligosaccharidmimikry zur Untersuchung von Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden neue Oligosaccharidmimetika in Form von S-Glycopeptiden über eine kombinatorische SPOT-Synthese mit S-Glycopeptid-Bausteinen dargestellt. Dazu wurden 1-Thioglycopyranosen über eine Mitsunobureaktion mit Aminoalkoholen (Spacer) und Asparaginsäure (Peptidrückgrataminosäure) zu den S-Glycopeptid-Bausteinen verknüpft. Dadurch konnten die Zucker (Monosaccharide, Disaccharide) und der Spacer (n-Pentyl-, Aminosäure-, Aromat-Spacer) über die Knüpfung von enzymatisch stabilen Thioethern gut variiert werden. Eine weitere Variante über eine 1,3-dipolare Cycloaddition ermöglichte die Synthese von Bausteinen mit 1,2,3-Triazol-Spacern. Anschließend erfolgte die Synthese der S-Glycopeptide über quantitative Peptidkuplungsreaktionen über ein Beta-Asparaginsäurerückgrat einzelner S-Glycopeptid-Bausteine. Dafür wurde die Asparaginsäure der S-Glycopeptid-Bausteine mit Pentafluorphenol unter Zugabe von Hydroxy-1,2,3-benzotriazol-4-(3H)-on aktiviert und das S-Glycopeptid vom N- zum C-Terminus stufenweie über eine Fmoc-Strategie aufgebaut. Durch Automatisierung mit einem SPOT-Roboter wurden aus 4 S-Glycopeptid-Bausteinen 256 neue S-Glycopeptide auf einer Zellulosemembran (9 cm x 13 cm) synthetisiert mit denen anschließend ein Lectin-Screening durchgeführt wurde. Dazu waren die Lectine mit Peroxidase (POD) markiert und konnten über eine Farbreaktion mit 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) auf der Membran sichtbar gemacht werden. Versuche mit dem Lectin Galentus nivalis (GNA) zeigten, dass die Spacer in den S-Glycopeptiden einen Einfluß auf die molekulare Erkennung haben. Bei einem weiteren Screening mit Phaseolus vulgaris E (PHA-E), konnte ein tetrameres S-Glycopeptid mit hoher Affinität identifiziert werden. Da PHA-E laut Literatur nur GalNAcbeta(1,2)Man als kleinste Zucker-Einheit erkennt, wurde dadurch gezeigt, dass die neuen S-Glycopeptid in der Lage sind Oligosaccharide zu imitieren. Der hohe Glycosylierungsanteil mit unterschiedlichen Zuckern, ihre leichte Zugänglichkeit über die S-Glycopeptid-Bausteine und ihre enzymatische Beständikeit machen die neuen S-Glycopeptide zu einem idealen Werkzeug zur Untersuchung von Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen.

The present work describes the combinatorial SPOT synthesis of glycopeptides designed as mimics for oligosaccharides from S-glycosyl amino acid building blocks. To this extend, 1-thioglycopyranoses were condensed with aminoalcohols (spacers) and asparaginic acid (amino acid for the peptide backbone) via Mitsunobu-Reactions to afford S-glycopeptide building blocks. Sugar (mono- and disaccharides) and spacer moiety (n-pentyl-, amino acid and aromatic spacers) were varied and coupled to asparaginic acid in order to form a thioether bond stable toward enzymatic cleavage. An additional variation of the spacer moiety was established by a 1,3-dipolar cycloaddition reaction affording 1,2,3-triazole spacers. Next, S-Glycopeptides were synthesized by peptide coupling procedures in quantitative yield. For this purpose, the asparaginic moiety of the S-glycopeptide building blocks was activated by means of pentafluorophenol and 1-hydroxy-1,2,3-benzotriazole-4-(3H)-on. S-Glycopeptides were constructed stepwise starting at the N-terminus using a Fmoc strategy. Automated SPOT synthesis on cellulose membranes afforded 256 novel S-Glycopeptides from 4 S-glycopeptide building blocks followed by a screening with lectins. The lectins were labeled with peroxidase (POD) in order to enable detection of their binding through a color reaction with 3-amino-9-ethyl-carbazole (AEC) directly on the membrane. Binding studies with the lectin Galentus nivalis (GNA) showed that the spacers of the S-glycopeptides play a role in the molecular recognition of the peptides. Yet another binding screening with lectin Phaseolus vulgaris E (PHA-E) which is known to only bind to GalNAcbeta(1,2)Man as the smallest recognized epitope revealed that the novel S-glycopeptides can indeed mimic oligosaccharides. Thus, the highly glycosylated S-glycopeptides described here are ideal tools for studying carbohydrate-protein interactions due to their simple accessibility from suitable S-glycopeptide building blocks.