Anaerobic biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons

Abstract

Aromatic hydrocarbons belong to the most important ground water contaminants. Especially in the absence of molecular oxygen their degradation proceeds very slowly, leading to the formation of long contaminant plumes and pollutant transport over long distances. Such processes endanger the drinking water supply in many areas. The objective of this work was the examination of microbial degradation pathways and enrichment of new cultures. Based on laboratory results, conclusions should be drawn about potential natural attenuation in contaminated ground water. The sulphate-reducing culture N47 can utilise naphthalene or 2-mnethylnaphthalene as the sole carbon source and electron donor. Anaerobic degradation of 2-methylnaphthalene is initiated by an addition of fumarate to the methyl group producing the first intermediate, naphthyl-2-methyl-succinate. In a subsequent b-oxidation of the original methyl atom, the central metabolite 2-naphthoic acid is generated. In the following pathway, the aromatic ring system is reduced, cleaved, and finally oxidized to CO2. The activities of two enzymes involved in the upper degradation pathway of 2-methylnaphthalene, succinyl-CoA:naphthyl-2-methyl-succinate CoA-transferase and naphthyl-2-methyl-succinyl-CoA dehydrogenase, were measured in crude cell extracts. Succinyl-CoA:naphthyl-2-methyl-succinate CoA-transferase was not inhibited by sodium borohydride or hydroxylamine indicating that this enzyme belongs to the family III of CoA-transferases similar to the corresponding enzyme in the anaerobic toluene degradation pathway. The enzymatic activity of naphthyl-2-methyl-succinyl-CoA dehydrogenase could only be detected using phenazine methosulphate (PMS) as electron acceptor. No activity was observed with natural electron acceptors such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) or flavin adenine dinucleotide (FAD). Also the activation mechanism of naphthalene was investigated. Contrary to previous reports postulating a carboxylation, it could be demonstrated that the initial reaction in the anaerobic degradation of naphthalene is methylation to 2-methylnaphthalene. Naphthyl-2-methyl-succinate and naphthyl-2-methylene-succinate, specific metabolites occurring exclusively during anaerobic degradation of 2-methylnaphthalene were detected during growth on naphthalene. Additionally, enzymes of the anaerobic 2-methylnaphthalene degradation pathway could be detected in naphthalene-grown cells with similar activities. When the cells were transferred from 2-methylnaphthalene to naphthalene, the lag-phase lasted for almost 100 days indicating that additional catabolic enzymes have to be activated in this case. In the opposite case, after the transfer from naphthalene to 2-methylnaphthalene, the cells grew immediately demonstrating that no new enzymes had to be induced. As contaminant plumes in ground water contain normally mixtures of numerous substances, the influence of diverse polycyclic and heterocyclic compounds on growth on naphthalene or on 2-methylnaphthalene was investigated. Cometabolic transformation of the majority of the offered cosubstrates was observed, whereas they were converted to the corresponding carboxylic acids, frequently to several isomers. Some compounds were methylated and transformed to the corresponding methyl-succinic acids. In few cases, a partial or total inhibition of growth was detected. As one of the principal obstacles in the investigation of anaerobic degradation of aromatic compounds is the lack of appropriate cultures, new enrichments with different substrates and electron donors were prepared. Amongst others, a novel sulphate-reducing biphenyl degrading enrichment culture was obtained. 4-biphenylic acid was detected in culture supernatants as a putative metabolite. The culture was also able to convert cometabolically 4-fluorobiphenyl to 4-flourobiphenyl-carboxylic acid. The data obtained during this work contribute significantly to a better understanding of anaerobic degradation of polycyclic aromatic compounds.

Aromatische Kohlenwasserstoffe gehören zu den häufigsten Schadstoffen im Grundwasser. Besonders in Abwesenheit vom molekularen Sauerstoff werden sie extrem langsam abgebaut, was zur Ausbildung langer Schadstofffahnen und ihrem Transport über lange Distanzen führt. So gefährden sie die Trinkwasserversorgung in vielen Gebieten. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung mikrobieller Abbauwege und Anreicherung neuer Kulturen. Auf Grundlage der Laborergebnisse sollten Aussagen über den potentiellen Schadstoffabbau im kontaminiertem Grundwasser getroffen werden. Die sulfatreduzierende Kultur N47 kann mit Naphthalin oder 2-Methylnaphthalin als einziger Kohlenstoffquelle und Elektronendonor wachsen. Der anaerobe Abbau von 2-Methylnaphthalin beginnt mit der Addition von Fumarat an die Methylgruppe, wodurch das erste Intermediat, Naphthyl-2-methyl-succinat, entsteht. Bei der folgenden b-Oxidation am ursprünglichen Methyl-Atom entsteht der zentrale Metabolit, 2-Naphthoesäure. Während des weiteren Abbaus wird das aromatische Ringsystem reduziert, gespalten und dann zu CO2 oxidiert. Die Aktivitäten zweier Enzyme des oberen Abbauweges von 2-Methylnaphthalin, succinyl-CoA:naphthyl-2-methyl-succinat CoA-Transferase und Naphthyl-2-methyl-succinyl-CoA Dehydrogenase, wurden in Zellextrakten gemessen. Succinyl-CoA:naphthyl-2-methyl-succinate CoA-Transferase wurde nicht durch Natrium Borhydrid oder durch Hydroxylamin inhibiert, was ein Hinweis auf die Zugehörigkeit dieses Enzyms zur Familie III der CoA-Transferasen ist, zu der auch das analoge Enzym des anaeroben Abbauweges von Toluol gehört. Die Aktivität der Naphthyl-2-methyl-succinyl-CoA Dehydrogenase konnte nur mit dem künstlichen Elektronenakzeptor Phenazinmethosulfat (PMS) gemessen werden. Keine Enzymaktivität war mit natürlichen Elektronenakzeptoren wie Nikotinamid-Adenindinukleotid (NAD+) oder Flavinadenin-Dinukleotid (FAD) messbar. Es wurde auch der Aktivierungsmechanismus von Naphthalin untersucht. Entgegen früheren Berichten, die eine Carboxylierung postulierten, konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass die Initialreaktion im anaeroben Naphthalinabbau eine Methylierung zu 2-Methylnaphthalin ist. Naphthyl-2-methyl-succinat und Naphthyl-2-methylen-succinat, zwei spezifische Metabolite, die ausschließlich während des anaeroben Abbaus von 2-Methylnaphthalin entstehen, wurden während des Wachstums auf Naphthalin in Kulturüberständen nachgewiesen. Zusätzlich konnten die Enzyme des anaeroben Abbauweges von 2-Methylnaphthalin während des Wachstums auf Naphthalin mit ähnlichen Aktivitäten nachgewiesen werden. Nachdem die Zellen von 2-Methylnaphthalin auf Naphthalin übertragen worden waren, dauerte die Lag-Phase nahezu 100 Tage, was darauf hindeutete, dass zusätzliche Enzyme aktiviert werden müssen. Im umgekehrten Fall, nach der Übertragung von Naphthalin auf 2-Methylnaphthalin, setzte das Wachstum sofort ein, wobei offensichtlich keine neuen Enzyme induziert werden mussten. Da die Schadstofffahnen im Grundwasser normalerweise Gemische zahlreicher Substanzen enthalten, wurde der Einfluss verschiedener polyzyklischer und heterozyklischer Substanzen auf das Wachstum auf Naphthalin oder 2-Methylnaphthalin untersucht. Es konnte kometabolische Umsetzung der meisten eingesetzten Substanzen beobachtet werden, wobei die Kosubstrate zu den entsprechenden Carboxylsäuren umgewandelt wurden, oft zu mehreren Isomeren. Manche Substanzen wurden methyliert und zu den entsprechenden Methylsuccinaten verstoffwechselt. In einigen Fällen konnte eine partielle oder völlige Inhibierung des Wachstums beobachtet werden. Da bei der Untersuchung des anaeroben Abbaus aromatischer Substanzen der Mangel an entsprechenden Kulturen eines der Haupthindernisse ist, wurden Anreicherungen mit verschiedenen Substraten und Elektronenakzeptoren durchgeführt. Unter anderen konnte eine neue sulfatreduzierende, biphenyl-abbauende Kultur angereichert werden. 4-Biphenylsäure wurde als potentieller Metabolit in den Kulturüberständen entdeckt. Die Kultur konnte ebenfalls 4-Fluorobiphenyl zu 4-Flourobiphenyl-Carboxylsäure kometabolisch umwandeln. Die während der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten tragen wesentlich zum Verständnis des anaeroben Abbaus polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe bei.