Qualitative und quantitative Analyse von Beta-Catenin in Catnb-mutierten hepatozellulären Tumoren der Maus mit Array-basierten Methoden

Abstract

Das Protoonkogen Beta-Catenin ist das terminale Effektormolekül im Wnt-/ Beta-Catenin-Signalweg. Seine zellulären Funktionen - Transkriptionsfaktor oder Zellstrukturmolekül - werden über Konzentration, Phosphorylierung und Komplexierung mit Cadherinen bestimmt. Daher wurden in Beta-Catenin-mutierten hepatozellulären Tumoren der Maus (i) das komplexe Phosphorylierungsmuster, (ii) die Komplexierung mit Cadherinen und (iii) die zelluläre Verteilung von Beta-Catenin untersucht, um einen Selektionsvorteil dieser speziellen Tumore zu erklären. Durch Etablierung multiplexer Mikroarray-basierter Sandwichimmunoassays waren diese Analysen mit minimalen Probenmengen durchführbar.

Die Messung der Gesamtkonzentration an Beta-Catenin in den Beta-Catenin-Tumoren ergab, wie auch schon von Aydinlik et al. (Oncogene, 2001) gezeigt, keine erhöhte Konzentration gegenüber dem Normalgewebe. Der Selektionsvorteil dieser hepatozellulären Tumore konnte somit nicht, wie z. B. bei Colon-Tumoren, auf eine erhöhte Gesamtkonzentration an Beta-Catenin zurückgeführt werden.

Nach dem Aufbau einer miniaturisierten Ko-Immunpräzipitation konnten funktionelle Beta-Catenin/ Cadherin-Komplexe auch in geringen Mengen Tumorlysat detektiert und so membranständiges Beta-Catenin über seinen Interaktionspartner Cadherin nachgewiesen werden. Die Ergebnisse weisen auf eine erhöhte cytosolische Menge an Beta-Catenin hin und geben eine mögliche neue Erklärung für einen Selektionsvorteil dieser Tumore. Gleichzeitig konnte eine erhöhte N-Cadherin- und eine erniedrigte E-Cadherin-Expression mit der Beta-Catenin-Mutation korreliert werden. Dies deutet auf einen so genannten Cadherin-Switch hin, welcher in Tumoren mit erhöhter Malignität beobachtet wird.

Die subzelluläre Lokalisation und der komplexe Phosphorylierungsstatus von Beta-Catenin in Lebergeweben und Zelllinien wurde mit Antikörpern untersucht, die über ein neu entwickeltes durchsatzfähiges Peptid-Mikroarray-basiertes System hinsichtlich Phosphoselektivität, Sequenzspezifität, Affinität und minimaler Bindesequenz charakterisiert wurden. Erstmals konnte die Lokalisation von Serin 45-phosphoryliertem Beta-Catenin im Kern von Maus-Lebernormalgeweben, Maus-Lebertumorgeweben und in unstimulierten Maus-Hepatomzelllinien gezeigt werden. Dies weist auf eine besondere Funktion dieser modifizierten Form von Beta-Catenin im Kern hin.

The terminal effector of the Wnt-/ beta-catenin signalling pathway is the protein beta-catenin. Its cellular function - transcription factor or structural protein - is determined by concentration, phosphorylation and the complexation by Cadherins. Mutation of the protein is of central importance during formation of certain types hepatocellular tumours in mice. To elucidate the selective effect of such mutations (i) the complex phosphorylation pattern, (ii) the complexation with Cadherins and (iii) the subcellular distribution of beta-catenin was investigated. The use of a microarray based assay format was a prerequisite to perform this study with since it allowed to do the experiments with a minimal amount of sample.

The data show that the total amount of beta-catenin is not elevated in beta-catenin tumours as compared to normal tissue. Therefore a selective advantage for the mouse tumours could not be ascribed to differences in the amounts of beta-catenin as found in other tumours of other tissues, e.g. colon carcinomas.

The development of a miniaturised co-immunoprecipitation allowed the detection of functional beta-catenin/ Cadherin complexes in a minute amount of tumour lysate. The membrane associated fraction of beta-catenin was quantified via its interaction partner cadherin and an elevated cytosolic concentration of beta-catenin was detected. Increased expression of N-Cadherin and an decreased expression of E-Cadherin correlates to the presence of a beta-catenin mutation in the examined tumours. This pattern is indicative for a high malignancy and is called cadherin switch.

The subcellular distribution and the complex phosphorylation status of beta-catenin in mouse liver tissue and cell lines was examined with antibodies. Phosphoselectivity, sequence specificity, affinity and minimal binding sequence of antibodies and recombinant binding molecules were determined. These experiments required the development of a peptid microarray based assay system. This system can be integrated in hybridoma or phage-display screening procedures to identify the most specific antibody. The localisation of serin 45 phosphorylated beta-catenin in the cell nucleus of normal mouse liver, liver tumour tissue and in unstimulated mouse hepatomas could be demonstrated. This localisation is desribed for the first time and may indicate a novel function of the phosphorylation.