Hitzeschockproteine: Interaktion mit HLA-DR-Molekülen und Einfluss auf die MHC II-vermittelte T-Zellantwort

Abstract

Autoimmunerkrankungen wie die Rheumatoide Arthritis (RA) gelten als T-Zellvermittelte Erkrankungen, deren Pathogenese eng mit der Expression definierter HLA (human leucocyte antigen) Klasse II-Moleküle assoziiert ist. Bei der RA wird dabei zwischen prädisponierenden und protektiven HLA-DR-Molekülen unterschieden. Neben dieser HLA-Assoziation spielen noch weitere Faktoren eine Rolle in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, beispielsweise wird eine Beteiligung von Hitzeschockproteinen (HSPs) diskutiert. HSPs können unter anderem Zellen des Immunsystems aktivieren, HSP-gebundene Peptide können von HLA-Klasse I-Molekülen re-präsentiert werden und eine T-Zell-Reaktivität auf HSP-Epitope scheint Einfluss auf den Verlauf von Autoimmunerkrankungen zu haben. In der Literatur wurde eine Interaktion von DnaK, dem HSP70-Molekül aus E.coli mit Peptidfragmenten aus RA-prädisponierenden HLA-DR-Molekülen beschrieben. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion von HSP70-Molekülen mit HLA-DR-Peptidfragmenten sowie ganzen HLA-DR-Molekülen näher zu charakterisieren, sowie die Auswirkungen einer direkten HSP:HLA-DR-Interaktion auf die MHC II-vermittelte Antigenpräsentation und CD4+ T-Zellaktivierung zu untersuchen. Mit einer sehr sensitiven Methode wurde das Bindungsverhalten von HLA-DR-Peptidfragmenten an verschiedene HSP70-Moleküle (dem stress-induzierbaren humanen Hsp70, dem konstitutiv exprimierten Hsc70 und DnaK aus E.coli) untersucht. Dabei wurde ein von der Literatur abweichendes Bindungsmuster gefunden, bei dem alle HLA-DR-Peptidfragmente eine Affinität zu HSP70 zeigten. Lediglich eine Peptidsequenz, die ausschließlich in RA-protektiven HLA-DR-Molekülen gefunden wird, besaß keine Affinität zu HSP70. Ein quantitatives Verfahren wurde etabliert, um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu untersuchen, ob auch die zu den Peptidfragmenten korrespondierenden ganzen HLA-DR-Moleküle mit HSP70 interagieren. Aus Zelllinien isolierte und rekombinant hergestellte HLA-DR-Moleküle zeigten dabei eine spezifische, hochaffine Interaktion mit humanem, stress-induzierbarem Hsp70. Die HLA-DR-Bindung an andere HSP70-Moleküle war nur sehr schwach ausgeprägt. Ein signifikant differentielles Hsp70-Bindungsmuster zwischen RA-prädisponierenden und RA-protektiven HLA-DR-Molekülen konnte für die ganzen Moleküle nicht gezeigt werden. Durch diese hier gefundene direkte Interaktion mit HLA-DR-Molekülen könnte Hsp70 hypothetisch als Peptid-„Carrier“ in der MHC II-vermittelten Antigenpräsentation dienen und damit eine Rolle in der CD4+ T-Zellaktivierung spielen. In einem humanen, antigenspezifischen System wurde der Einfluss von Hsp70 auf die CD4+ T-Zell-aktivierung untersucht. T-Zellen von Donoren mit verschiedenen HLA-DR-Haplotypen wurden mit Peptiden oder Hsp70:Peptid-Komplexen stimuliert und die Anzahl proliferierter CD4+ T-Zellen bestimmt. Antigenspezifität proliferierter T-Zellen wurde mittels HLA-DR-Tetramer-Färbung gezeigt. Die Stimulation mit Hsp70:Peptid-Komplexen führte zu einer deutlich verstärkten Proliferation antigenspezifischer CD4+ T-Zellen, insbesondere unter Bedingungen mit äußerst geringen Peptidmengen oder einer reduzierten Zahl antigenpräsentierender Zellen. Die vorausgehende Komplexierung von Hsp70 mit dem Peptid war essentiell für diese Hsp70-abhängige Proliferationsverstärkung, Kontrollproteine zeigten keinen Effekt. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass HSP70-Moleküle an HLA-DR-Peptidfragmente mit unterschiedlicher Affinität binden können. Intakte HLA-DR-Moleküle können spezifisch mit humanem Hsp70 interagieren. Eine verstärkte Immunogenität von Hsp70-gebundenen Peptiden bei der Stimulation humaner, antigenspezifischer CD4+ T-Zellen wurde gefunden.

Inheritance of specific HLA (human leucocyte antigen) class II alleles can greatly influence the risk for autoimmune diseases like rheumatoid arthritis (RA). In the pathogenesis of RA some HLA-DR alleles are considered to predispose to this autoimmune disorder, whereas others seem to mediate protection. In addition to HLA-association, other mechanisms are influencing the pathogenesis of RA. In this context the involvement of heat shock proteins (HSPs) is discussed. HSPs are involved in activating cells of the immune system, HSP-chaperoned peptides can be re-presented via MHC I molecules and T cell reactivity to epitopes from HSPs may influence the pathogenesis of autoimmune diseases. An interaction between DnaK, the HSP70 from E.coli and peptide fragments from RA-predisposing HLA-DR molecules was described in the literature. The aim of this study was to investigate the interaction of HSP70 molecules with HLA-DR derived peptide fragments and the corresponding complete HLA-DR molecules and to evaluate the effects of a possible direct HSP-MHC-interaction on MHC II-restricted antigen presentation and CD4+ T cell activation. Using a highly sensitive method, binding studies with different HSP70 molecules (stress inducible human cytosolic Hsp70, constitutively expressed Hsc70 and E.coli DnaK) revealed a binding pattern differing from those described in literature: It was found that HLA-DR derived peptide fragments from most HLA-DR molecules interact with HSP70. Only a single peptide sequence found in HLA-DR molecules associated with strong protection from RA showed no HSP70-affinity. A quantitative binding assay was established to quantify peptide binding studies and to analyze whether the corresponding complete HLA-DR molecules also interact with HSP70. A specific interaction between the human stress-inducible Hsp70 and HLA-DR molecules isolated from cell lines and recombinant HLA-DR molecules could be demonstrated in these experiments. Other tested HSP molecules showed only a weak affinity to complete HLA-DR molecules. A differential Hsp70-bindiung pattern between the different allelic variants of HLA-DR could not be confirmed. With the direct interaction between Hsp70 and HLA-DR molecules demonstrated in this work a scenario might be conceivable in which Hsp70 might function as peptide-carrier in the MHC II-restricted presentation of antigenic peptides and thus might play an important role in the activation of CD4+ T cells. Therefore the effect of Hsp70 on CD4+ T cell activation was tested in a human antigen-specific setting. T cells from donors with different HLA-DR haplotypes were stimulated either with antigenic peptides alone or with Hsp70:peptide complexes. Hsp70:peptide complexes were found to amplify the proliferation of antigen-specific CD4+ T cells as confirmed by HLA-DR tetramer staining. Complex formation of the antigenic peptide with Hsp70 was absolutely required to elicit an antigen-specific amplification, control proteins showed no enhanced proliferation. This effect was most pronounced at low doses of antigen and decreasing APC:CD4+ T cell ratios. Taken together it was shown in this work that HSP70 molecules can interact differentially with HLA-DR peptide fragments. A specific interaction between Hsp70 and complete HLA-DR molecules could be demonstrated. The potential of Hsp70 to enhance antigen-specific CD4+ T cell proliferation and to increase the immunogenicity of presented peptides in human CD4+ T cells was shown.