Miniaturisierte und parallelisierte Assaysysteme zur Charakterisierung von Bindemolekülen: Entwicklungen für den Nachweis tumorrelevanter Markerproteine

Abstract

Durch heutige Genom- oder Expressionsanalysen sind eine Fülle an Informationen zugänglich geworden, mit deren Hilfe Funktion und Bedeutung der Gene und Proteine im globalen Maßstab abgeleitet werden können. Zum vollständigen Verständnis komplexer biologischer und klinisch relevanter Prozesse und Zustände bedarf es jedoch der Identifizierung und Charakterisierung der molekularen Bestandteile eines Organismus, welche direkt an diesen Prozessen beteiligt sind. Proteine nehmen hierbei eine bedeutende Funktion ein. Zur Analyse der Bestandteile einer Probe können hierfür Mikroarray-basierende Assaysysteme eingesetzt werden. Mit diesen miniaturisierten und parallelisierten Ligandenbindungsassays lassen sich in einem einzigen Experiment eine Vielzahl an Parametern unter minimalem Probenverbrauch bestimmen. Diesen Systemen kommt im Zeitalter nach der Entschlüsselung des menschlichen Genoms eine wachsende Bedeutung zuteil, da sie als Protein-Mikroarrays der Proteom-Forschung als ein potentielles Hilfsmittel für globale analytische Ansätze dienen können. So werden gegenwärtig mit Protein-Mikroarray-basierenden Experimenten eine Vielzahl an Zielmolekülen und deren Aktivierungszustände qualitativ und quantitativ bestimmt. Zudem werden Interaktionsstudien für verschiedenste Proteine über immobilisierte Fängermoleküle wie Proteine, Peptide, Oligosaccharide und niedermolekulare Substanzen oder DNA durchgeführt. Eine Limitierung der Protein-Mikroarrays ist jedoch auf einen Mangel an eingehend charakterisierten, spezifischen und selektiven Fängermolekülen zurückzuführen, mit welchen Anwesenheit, Funktion, Interaktion, Regulation und Zusammenspiel einer Vielzahl an Proteinen in multiparametrischen Ansätzen analysiert werden können.

In der vorliegenden Arbeit wurden im Rahmen des BMBF-Förderprojektes pepART verschiedene miniaturisierte und parallelisierte Assaysysteme entwickelt, die der Charakterisierung von unterschiedlichen Klassen von Bindemolekülen dienen. In entwickelten und etablierten Assays mit Antikörpern und alternativen Bindemolekülen wurden die tumorrelevanten Markerproteine EGFR und Her2 qualitativ und quantitativ bestimmt. Es wurde eine Methode zur Herstellung planarer Zell-Mikroarrays aus verschiedenen Zelllinien etabliert. Diese Methode erlaubte Antikörper zu charakterisieren, die gegen membranständige Proteine generiert worden waren. Die auf Zell-Mikrospots gebunden Antikörper wurden mit einem fluoreszenz-basierenden Reportersystem visualisiert, womit sich die Spezifität und Kreuzreaktivität der Antikörper bestimmen ließ. Kernpunkt dieser Dissertation war die Entwicklung bead-basierende Assaysysteme zur Charakterisierung peptidspezifischer Antikörper. Am Beispiel von scFv-Antikörperfragmenten wurden die methodischen Grundlagen zur Bestimmung der Affinität, des Bindungsbereiches sowie der Fängereigenschaften nach einer Immobilisierung ausgearbeitet. Es gelang hierbei, nicht gereinigte Binder direkt aus Rohextrakten zu charakterisieren. Für Entwicklungen zur peptidspezifischen Proteomanalyse wurden die Modellproteine Her2 und EGFR in silico tryptisch verdaut. Aus den erhaltenen Fragmenten wurden in Kooperation mit der MorphoSys AG peptidspezifische Antikörper generiert. In einem multiparametrischen Screening-Ansatz wurden insgesamt 3072 Fab-Antikörperklone hinsichtlich Spezifität, Kreuzreaktivität und Expression analysiert. Mittels Kompetitionsexperimenten wurden peptidspezifische Antikörper identifiziert. Darüber hinaus wurde ein miniaturisierter Ligandenbindungsassay zum Nachweis von funktionellem EGFR entwickelt. EGFR-Moleküle wurden aus charakterisierten Brusttumorproben bestimmt. Als weitere Klasse von Bindemolekülen wurden Her2-spezifische Ankyrine getestet. Ein sensitiver Her2 Sandwich-Immunoassay wurde aufgebaut, mit dem der Her2-Gehalt von Zell- und Gewebeproben qualitativ und quantitativ bestimmt wurde.

Data derived from genome and expression analysis can provide information about function and significance for numerous amounts of genes and proteins. In order to fully understand the complexity of biological and clinically relevant processes and conditions, those molecules actually taking part in cellular events have to be identified and characterised in more detail. In many of these processes proteins are the key players. Using microarray based assay system a large number of parameters can be analysed simultaneously from a minute amount of sample within a single experiment. In the post genomic area these miniaturised and parallelised ligand-binding assay systems are of great interest since they can provide a tool for global analytical approaches for proteome research. For this purpose, protein microarrays can be performed to identify and quantify target molecules of interest or to study protein interactions. A prerequisite for these multi-parametric immunoassays is the availability of well characterised, highly specific and selective binding molecules.

This thesis is addressed to provide fast and efficient methods for the characterisation and selection procedures of binding molecules. For these purposes methods were developed for and with protein microarray based approaches. Antibodies and alternative binding molecules were used to develop an assay for the analysis of the tumour relevant target proteins EGFR and Her2. In a first approach, a cell microarray based approach was tested to characterize cell surface specific antibodies. Cells were immobilised in microspots on a planar support and used for presentation of membrane bound antigens. Antibodies that bound to cell surface molecules were visualised with a fluorescent-based reporter system. This study shows the system’s capability to determine antibodies’ cross-reactivity and selectivity. A focus of this thesis was the design of a screening procedure to examine binding properties of proteins from crude extracts using bead-based microarrays. Studying anti-GCN4 peptide-specific single chain (scFv) antibodies as a model system, strategies and protocols for the determination of affinity, multiplexed epitope mapping and analysis of capture activity were developed. These results were applied to the concept of the BMBF-funded pepART project, where antibody microarrays are to be used for a peptide based proteome analysis. Signature peptides derived from an in silico tryptic digestion of EGFR and Her2 were chosen, synthesised and selected for the generation of antibodies from the phage-display library of the project partner MorphoSys AG. A total number of 3072 antibody clones were screened for specificity, cross-reactivity and expression using multiplexed bead-based approaches. A panel of peptide specific binders could be selected. An approach to study functionality of cell surface receptors is the application of naturally interacting binding partners. Here, EGF had been immobilised on beads and was utilised to capture functionally active EGFR in a ligand-binding assay. Characterised breast cancer patient samples were available and grouped at a clinical EGFR cut-off. Experimental results from the bead-based assay showed that a median fluorescence intensity value of more than 50 AU always correlated with an EGFR expression level above cut-off. However, this assay system required membrane fractions of the tumour samples to achieve appropriate results and lacked sensitivity. As binding molecules with an alternative scaffold, ankyrin repeat proteins specific for Her2 were studied. Directed immobilisation strategy and multiplexed bead-based assay were employed to select ankyrin clones as capture reagents for Her2 detection. An ankyrin-antibody sandwich immunoassay was developed and the protein standard was detected with sensitivity below 0.2 pM. Patient tissue samples were analysed and 1 µg of total protein lysate per assay was sufficient to confirm the Her2 status of breast cancer samples that had been analysed in a routine clinical laboratory. The assay developments presented in this thesis employ and aid the progression of protein microarray based approaches by the description of protocols for single- and multiplexed characterisation of binding molecules.