Extrazelluläre Proteasen aus Mikroorganismen: Reinigung, Charakterisierung und Fixierung auf Polyester

Abstract

Die Arbeit beschreibt die Gewinnung von Proteasen, die für technische Anwendungen eingesetzt werden können. Hierfür wurden zwei extrazelluläre thermophile Proteasen aus den Bakterienstämmen S. thermovulgaris bei 50°C und Paenibacillus sp. bei 30°C kultiviert und erfolgreich isoliert. Beide Bakterienstämme stammen aus nigerianischen Bodenproben und wiesen gute Wachstumseigenschaften auf. Die Exoenzyme wurden durch ein einfaches und effektives Reinigungsverfahren mittels einer Ammoniumsulfatfällung sowie einer anschließenden Ionenaustausch- bzw. Gelfiltrationschromatographie aus dem zellfreien Medium in homogener Form gewonnen. Die Größenbestimmung mittels SDS-PAGE ergab für die Protease aus Paenibacillus sp. eine Molmasse von 18 kDa und für die Protease aus S. thermovulgaris eine Molmasse von 24 kDa. Zur Charakterisierung der Proteasen wurde deren Spezifität in Bezug auf verschiedene synthetische Substrate und spezifische Hemmstoffe untersucht. Dabei resultierte für beide Proteasen eine chymotrypsinähnliche Spezifität. Ebenso ergab die Hemmung mit Phenylmethylsulfonylfluorid und 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid, dass es sich bei den beiden isolierten Proteasen um Serinproteasen mit chymotrypsinähnlicher Spezifität handelt. Dagegen zeigten Hemmstoffe gegen Metalloproteasen und den Cysteinproteasen keine Wirkung. Die Stabilitätsuntersuchungen beider Proteasen hinsichtlich Temperatur und pH-Einflüssen ergaben für die Protease aus S. thermovulgaris ein Temperaturmaximum bei 65°C und ein pH-Optimum zwischen 9-10. Bei der Protease aus Paenibacillus sp. wurde ein Tmax von 45°C ermittelt. Diese Protease zeigte bei pH 8-9 höchste Stabilität. Abschließend wurde die Stabilisierung der Proteasen und damit deren technische Anwendbarkeit überprüft. Hierzu wurden beide Proteasen an Polyester-Vlies als festes Trägermaterial über einen Spacer immobilisiert und die Enzymaktivität der immobilisierten Proteasen mittels Azocasein nachgewiesen.

The thesis describes the isolation, purification and characterization of two extracellular thermophilic proteases from the strains S. thermovulgaris and Paenibacillus sp. Both strains were obtained from Nigerian soil and showed good growing features. The exoenzymes were effectively purified by using a fractionated ammonium sulfate precipitation followed by a ion-exchange and size exclusion chromatography, respectively. The molecular mass was examined by SDS-PAGE. For the proteases isolated from Paenibacillus sp. a molecular mass of 18 kDa , and for the proteases from S. thermovulgaris, a value of 24 kDa was obtained. The specificity of both proteases were characterized by testing several synthetic substrates and specific inhibitors. As a result both proteases showed chymotrypsin-like specifity. In addition the inhibition with phenylmethanesulfonylfluoride and 4-(2-aminoethyl)-benzene-sulfonylfluoride proved the existence of serine proteases with chymotrypsin-like specifity. Other inhibitors for other types of proteases did not affect their activity. The temperature- and pH-stability of both proteases were investigated. The optimum pH and temperature values for enzyme activity of the protease from S. thermovulgaris and Paenibacillus sp. were examined at pH 9-10, Tmax=65°C, and pH 8-9, Tmax =45°C, respectively. Finally, the possibility for technical use were investigated by immobilization of the enzymes.