Functional characterization of promoter polymorphisms in the human Cytochrome P450 2B6 gene (CYP2B6)

Abstract

Human Cytochrome P450 2B6 (CYP2B6) belongs to the superfamily of Cytochrome P450 enzymes which catalyze a vast variety of biotransformations, mainly oxidations, of numerous endogenous substrates and xenobiotics. Drugs predominantly metabolized by this enzyme include, among others, the anticancer prodrug cyclophosphamide, the narcotic propofol, the antidepressant bupropion, the antimalarial drug artemisinin and the reverse transcriptase inhibitor efavirenz. In several works, a high variability in hepatic expression of CYP2B6 has been observed, part of which can be attributed to induction phenomena similar to the rodent CYP2B genes. Additionally, CYP2B6 has been shown to be highly polymorphic in the coding region as well as in the promoter region, and certain nonsynonymous SNPs have been associated with altered hepatic expression or activity of the protein. In this work, the impact of promoter polymorphisms on transcription of the human CYP2B6 gene was investigated. A comprehensive haplotype analysis was conducted using 2.3 kb of promoter sequence data and genotypes for all common nonsynonymous SNPs from 96 individuals of Caucasian origin. Erroneous genotyping for the SNP c.1459C>T in exon 9 was observed with the PCR-RFLP assay described previously by Lang et al. (2001) resulting from a mutation in a primer binding site in intron 8, and an alternative assay was developed. The presence and frequency of the major haplotypes present among Caucasians was confirmed except for the CYP2B6*7 allele which was shown to be a potential artifact caused by faulty genotyping of the mutation c.1459C>T. For functional investigations of the promoter polymorphisms, HepG2-cells and primary rat and human hepatocytes were transfected with luciferase reporter gene constructs driven by 2033 bp of the most frequent promoter variants *1A, *1J, *1N and *22. The novel haplotype *22 (-1848C>A, -801G>T, -750T>C and -82T>C) showed three- to ninefold enhanced transcriptional activity compared to *1A representing the wild type in all transfected cells. Constructs containing single mutations surprisingly revealed -82T>C, predicted to disrupt a putative TATA box, to be alone responsible for this effect. In silico analysis and electrophoretic mobility shift assay demonstrated conversion of the putative TATA box into a functional C/EBP binding site. Analysis of transcriptional start sites by 5’-RLM-RACE and primer extension showed the mutant promoter to be transcribed from a start site located about 30 bp downstream of the wild type start site, consistent with the use of a noncanonical TATA box at -55 bp. For genotyping the SNP -82T>C in a large human liverbank, a DHPLC assay was established. The subsequent phenotype-genotype correlation analysis showed that median CYP2B6 mRNA expression and bupropion hydroxylase activity as a selective marker of CYP2B6 catalytic activity were about twofold higher in livers genotyped -82TC as in those genotyped -82TT (20.4 vs. 9.8 a.u., p=0.007, and 201.8 vs. 106.7 pmol/mg*min, p=0.042, respectively). This promoter polymorphism thus contributes to CYP2B6 functional variability and represents a novel mechanism by which mutations can enhance transcription. The SNP -750T>C was also investigated as it was predicted to disrupt a putative HNF1 binding site. Although a reduction in affinity of HNF1 to the promoter was observed in electrophoretic mobility shift assay when the mutation was present, no significant differences in reporter gene assays or hepatic expression were seen in relation to this mutation. In contrast, the CYP2B6*6B allele containing this SNP was shown to result in significantly reduced expression in human liver samples at the mRNA, protein and activity level. Thus, median mRNA levels were 11.2 vs. 7.2 a.u. (p=0.017), median microsomal protein content was 14.2 vs. 7.3 pmol 2B6/mg protein (p=0.008), and median bupropion hydroxylase activity was reduced from 121.2 to 79.9 pmol/mg*min (p=0.020) in non-carriers vs. carriers of the CYP2B6*6 allele. Furthermore, a detailed inter-species comparison of CYP2B promoters and transcriptional start sites provided novel insights into evolutionary relationships and constitutive regulation of this gene (Zukunft et al., 2005).

Das humane Cytochrom P450 2B6 (CYP2B6) gehört zu der Superfamilie der Cytochrom-P450-Enzyme, die eine Vielfalt von Biotransformationen, vornehmlich Oxidationen, verschiedenster körpereigener und -fremder Substrate katalysieren. Zu den Arzneistoffen, die fast ausschließlich von diesem Enzym metabolisiert werden, zählen unter anderem das Cytostatikum Cyclophosphamid, das Anästhetikum Propofol, das Antidepressivum Bupropion, das Antimalariamittel Artemisinin und der nichtnukleosidische Reverse-Transkriptase-Hemmer Efavirenz. In verschiedenen Arbeiten wurde eine hohe Variabilität der hepatischen Expression des CYP2B6 beobachtet, die teilweise seiner den CYP2 Genen der Nager analogen Induzierbarkeit zugeschrieben werden kann. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass CYP2B6 sowohl in der Promotorregion als auch im kodierenden Bereich hochpolymorph ist, und verschiedene zu einem Aminosäureaustausch führende Mutationen wurden mit einer veränderten Expression oder Aktivität des Proteins assoziiert. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Promotorpolymorphismen auf die Transkription des humanen CYP2B6-Gens untersucht. Sequenzierungsdaten von einem 2,3 kb umfassenden Bereich des Promotors sowie Genotypisierungsdaten für alle häufigen nichtsynonymen SNPs von 96 Kaukasiern wurden für eine umfassende Haplotypenanalyse verwendet. Fehlerhafte Genotypisierungen mit der von Lang et al. (2001) beschriebenen PCR-RFLP-Methode für die Mutation c.1459C>T wurden beobachtet, die sich auf eine Mutation in einer Primerbindestelle im Intron 8 zurückführen ließen, und eine alternative Methode wurde etabliert. Die Präsenz und Häufigkeiten der wichtigsten Haplotypen bei Kaukasiern konnten bis auf Ausnahme des Allels CYP2B6*7 bestätigt werden. Für dieses wurde gezeigt, dass es sich wahrscheinlich um ein durch fehlerhaftes Genotypisieren der Mutation c.1459C>T verursachtes Artefakt handelt. Für die funktionelle Untersuchung der Promotorpolymorphismen wurden HepG2-Zellen sowie aus Ratten und Menschen isolierte primäre Hepatozyten mit Reportergenkonstrukten transfiziert, von denen das Luziferasegen unter der Kontrolle von 2033 Basenpaaren der häufigsten Promotorvarianten *1A, *1J, *1N und *22 transkribiert wird. Der neu beschriebene Haplotyp *22 (-1848C>A, -801G>T, -750T>C und -82T>C) zeigte in allen transfizierten Zellen eine drei- bis neunfach erhöhte Transkriptionsaktivität im Vergleich zu *1A, das den Wildtyp repräsentiert. Überraschenderweise konnte durch Reportergenkonstrukte mit einzelnen Mutationen der SNP -82T>C, der eine mutmaßliche TATA-box zerstört, als die alleinige ursächliche Mutation identifiziert werden. Computeranalysen und „electrophoretic mobility shift assay“ zeigten, dass die potentielle TATA-box in eine funktionelle C/EBP-Bindestelle umgewandelt wird. Transkriptionsstartanalysen mittels „5’-RLM-RACE“ und „primer extension“ ergaben, dass beim mutierten Promotor die Transkription ungefähr 30 Basen stromabwärts der regulären Transkriptionsstartstelle einsetzt, was auf die Verwendung einer nichtkanonischen TATA-Box bei -55 bp schließen ließ. Eine DHPLC-Methode zur Genotypisierung des SNPs -82T>C in einer umfangreichen humanen Leberbank wurde entwickelt. In der anschließenden Genotyp-Phänotypkorrelation erwies sich, dass die mediane CYP2B6 mRNA-Expression und die Bupropionhydroxylaseaktivität als spezifische Nachweisreaktion für CYP2B6-Aktivität in Lebern mit Genotyp -82TC gegenüber denen mit Genotyp -82TT etwa zweifach erhöht waren (20,4 vs. 9,8 a.u., p=0,007, und 201,8 vs. 106,7 pmol/mg*min, p=0,042). Folglich trägt dieser Promotorpolymorphismus zur funktionellen Variabilität des CYP2B6 bei und stellt einen neuartigen Mechanismus dar, wie eine Mutation die Transkription verstärken kann. Des weiteren wurd der SNP -750T>C untersucht, bei dessen Anwesenheit die Zerstörung einer mutmaßlichen HNF1-Bindestelle vorhergesagt wurde. Obwohl in Gegenwart der Mutation eine Abschwächung der Promotoraffinität von HNF1 im „electrophoretic mobility shift assay“ beobachtet wurde, waren signifikante Unterschiede bezüglich dieser Mutation weder bei den Reportergenversuchen noch bei der hepatischen Expression zu sehen. Im Gegensatz dazu konnte für das Allel CYP2B6*6B, das diese Mutation enthält, eine verringerte Expression in humanen Leberproben auf mRNA-, Protein- und Aktivitätsebene beobachtet werden. So war bei Nichtträgern bzw. Trägern des CYP2B6*6-Allels die mediane mRNA-Expression 11,2 vs. 7,2 a.u. (p=0,017), der mediane mikrosomale Proteingehalt betrug 14,2 vs. 7,3 pmol 2B6/mg Protein (p=0,008), und die mediane Bupropionhydroxylaseaktivität war von 121,2 auf 79,9 pmol/mg*min (p=0,020) reduziert. Des weiteren wurde ein detaillierte Gegenüberstellung von CYP2B-Promotoren und Transkriptionsstartstellen verschiedener Spezies vorgenommen, die neue Einblicke in die evolutionäre Entwicklung und konstitutive Regulation dieses Gens gewährt.