Elektrophysiologische Untersuchungen an rekombinanten kardiovaskulären KATP-Kanälen: Effekte von Nukleotiden, neuartigen KATP-Kanalöffnern und Blockern

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-18074
http://hdl.handle.net/10900/48777
Dokumentart: Dissertation
Date: 2005
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Quast, Ulrich
Day of Oral Examination: 2005-03-03
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Kalium-Kanalöffner , ATP , ADP
Other Keywords: Glibenclamid , PIP2 , DIDS , SUR2 , Kir6.2
Glibenclamide , PIP2 , DIDS , SUR2 , Kir6.2
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Inhaltszusammenfassung:

In dieser Arbeit wurden die Effekte von Nukleotiden, KATP-Kanalblockern und -öffnern auf die Aktivität v. a. der rekombinanten kardiovaskulären KATP-Kanäle mit der patch-clamp-Technik untersucht. Die Aktivität der KATP-Kanäle wird durch Nukleosid-di- und -triphosphate reguliert. Dies wurde in dieser Arbeit primär an Kir6.2/SUR2A-Kanälen, der rekombinanten Form der Kanäle in Herz- und Skelettmuskelzellen untersucht. In Abwesenheit von Mg2+ beobachtet man eine Hemmwirkung (ATP: IC50=12 µM; ADP: IC50 ~ 800 µM). In Gegenwart von Mg2+ ergibt sich für ATP eine leichte Rechtsverschiebung der Hemmkurve (IC50=30 µM). Bei MgADP hingegen wird ein biphasischer Effekt beobachtet: bei niedrigen Konzentrationen ergibt sich eine Aktivierung um ca. 100 % (mit EC50=3 µM); bei hohen Konzentrationen eine Hemmung (IC50=600 µM). Es ist wahrscheinlich, dass der Hemmung immer der gleiche, Mg2+ unabhängige Prozess, zugrunde liegt. Die Aktivierung durch Nukleosidphosphate benötigt dagegen Mg2+. Bei MgADP kann man die beiden Komponenten getrennt analysieren; bei MgATP liegen sie jedoch so dicht beieinander, dass die Überlagerung der beiden Effekte zu einer leichten Rechtverschiebung der beobachteten Hemmkurve führt. Es gibt einen eindeutigen Zusammenhang zwischen der aktivierenden Wirksamkeit von MgADP und der Größe des beobachteten Rundown in den einzelnen Patches. Der molekulare Mechanismus für diese Beobachtung ist unklar. Die Hemmwirkung der Nukleosidphosphate ist vom Rundown unabhängig. Von den Blockern des KATP-Kanals wurde je ein Beispiel aus drei verschiedenen Substanzklassen untersucht, der Standard-Sulfonylharnstoff Glibenclamid, der kardioselektive Sulfonylthioharnstoff HMR 1883 sowie der aus der Öffnerstruktur der Cyanoguanidine (Pinacidil) abgeleitete Blocker PNU-96293. Alle drei Blocker schließen den Kanal durch Bindung am SUR. Untersuchungspunkte waren die Effizienz der Blocker in Abhängigkeit von der patch-clamp Konfiguration (Ganzzelle- vs i/o patch), der Effekt von Nukleotiden auf den Block, eine eventuelle Selektivität für einer der Kanal- Subtypen sowie der Effekt der Mutation SUR2A(Y1206S). In der Ganzzellkonfiguration zeigen die KATP-Kanalblocker Glibenclamid und HMR1883 als Antagonisten einen vollständigen Block der Kir6.2/SUR2x-Kanäle; die hemmung durch PNU-96293 hingegen ist nicht vollständig. PNU-96293 ist daher ein Partialantagonist. Im Inside-Out-Patch erreichen alle drei Substanzen nur eine partiellen Block (50-70 %). Dies zeigt daß je nach den Umständen vollständig mit Blockern besetzte Kanalspezies noch eine Offenwahrscheinlichkeit >0 haben. Die MgADP-Empfindlichkeit des Blockes wurde für Glibenclamid und HMR1883 im i/o patch untersucht. Unter MgADP zeigen beide Substanzen eine signifikante Abnahme der Potenz des Blockes aber nicht der maximalen Hemmung. Bei der Erhebung des Selektivitätsprofils der Blocker zeigen sich leichte Differenzen zwischen den Substanzen; quantitativ hängen die Unterschiede auch von der patch-clamp Konfiguration ab. Die Mutation Y1206S in den SUR2-Subtypen erhöht die Potenz der inhibitorischen Wirkung von Glibenclamid an den Kir6.2/SUR2(YS)-Kanälen ~ 30x (i/o patch, keine Nukleotide); in der Ganzzellkonfiguration ist der Unterschied kleiner. Bei PNU-96293 beträgt der Effekt der Mutation nur 1,7x, was auf eine andere Bindungsstelle dieser Substanz am SUR hinweist. Bezüglich der KATP-Kanalöffner wurden drei Aspekte untersucht:(1) die Öffnung des Kir6.2/SUR2B Kanals in der Abwesenheit von MgATP durch Öffner verschiedener Strukturklassen; (2) die Wirkung von A312110, einem neuartiger Öffner aus der Klasse der Dihydropyridine; (3) die kanalöffnende Wirkung des Stilbens DIDS. Die Öffnung von KATP-Kanälen durch KATP-Kanal-Öffner wird durch MgATP sehr stark gefördert. Der MgATP-abhängige Signalweg beruht auf einer Öffner-induzierten Steigerung der ATPase-Aktivität des SUR und der Stabilisierung des Proteins in einer posthydrolytischen Konformation. Andererseits können hohe Konzentrationen von Öffnern den KIR6.x/SUR2-Kanäle in Abwesenheit von MgATP öffnen. Ziel meiner Untersuchungen war es, die Öffnung von KIR6.2/SUR2B-Kanälen durch P1075, Minoxidilsulfat, Diazoxid und Nicorandil in Abwesenheit von Mg2+ zu erfassen. Die Messungen zeigen, dass die Öffner bezüglich dieses Effektes in verschiedene Klassen eingeteilt werden können, und dass bei P1075 der MgATP-unabhängige Weg ab 10-fach höheren Konzentrationen bis zu 20 % zur Kanalöffnung in Anwesenheit von MgATP beitragen kann. Das neue Dihydropyridin A312110 erwies sich an Kir6.2/SUR2A und /SUR2B Kanälen als ebenso potenter Öffner wie der Standardöffner P1075; allerdings ist die Effektivität der Öffnung beo A312110 etwas geringer. Das Stilben DIDS blockt mit mikromolarer Potenz KATP-Kanäle (SUR1, SUR2A, SUR2B koexprimiert mit Kir6.2). Hier wird zum ersten Mal gezeigt, dass DIDS in nM Konzentrationen den Kir6.2/SUR2B-Kanal öffnen kann; die Öffnung tritt jedoch nur in ca. 65 % der Experimente auf. Die aktivierende Wirkung setzt am SUR an, da KIR6.2D26-Kanäle nicht aktiviert werden, und benötigt MgATP. Die PI-3-Kinaseinhibitoren LY-294002 und Wortmannin sowie OleylCoA haben keinen Einfluss auf die aktivierende Wirkung, so dass der Aktivierungsmechanismus dieses Stibens PIP2/PIP3 unabhängig ist. Zusammenfassend kann man sagen, daß das auffallendste Ergebnis der Arbeit die starke Abhängigkeit der quantitativen Effekte der Schließer und Öffner der KATP-Kanäle von der Konfiguration der patch-clamp Technik ist. Ein zweites Hauptergebnis ist die starke Beeinflussung der Pharmakawirkungen durch die Gegenwart von Nukleotiden. Die Arbeit zeigt die ganze Komplexität in der Modulation dieser Kanäle, die als metabolische Sensoren der Zelle außer von Nukleotiden auch von anderen Zellbestandteilen wie dem Zytoskelett und Phospholipiden entscheidend beeinflußt werden.

Abstract:

KATP channels are gated by intracellular nucleotides, i.e. they are closed by ATP and opened by MgADP. In this thesis work, the effect of nucleotides, channel blockers, and openers on the activity of recombinant cardiovascular KATP channels was investigated using the patch-clamp technique in the whole cell and the i/o patch configurations. The effects of nucleotides were investigated using the Kir6.2/SUR2A channel. In the absence of Mg2+, inhibition was observed (ATP: C50=12 µM; ADP: IC50 ~ 800 µM). In the presence of Mg2+, the inhibition curve of ATP was slightly shifted rightwards (IC50=30 µM). With MgADP, a biphasic effect was observed: At low concentrations, activation by ~100 % was seen with EC50=3 µM; at high concentrations, inhibition (IC50=600 µM). It is probable that inhibition by ATP and MgATP is due to the same process (i.e. binding to Kir6.2). The activation by nucleoside phosphates requires Mg2+ and relies upon binding of MgADP to SUR. In case of MgADP, the activatory and inhibitory components are well separated on the concentration scale; for MgATP, the components lie close to one another so that only a slight rightward shift of the inhibition curve by Mg2+ is seen. In the individual patches we observed a strong correlation between the magnitude of the activatory effect of MgADP and the run down of the channels; the underlying molecular mechanism remains unknown. The inhibitory action of nucleoside phosphates is independent of run down. Amongst the KATP channel blockers, examples of three different structural classes were examined, i.e. the sulphonylurea, glibenclamide, the cardioselective sulphonylthiourea, HMR 1883, as well as PNU-96293, which is derived from the channel opening cyanoguanidines like pinacidil. All three blockers close the channel by binding to SUR. Main points of interest were the dependence of block on the patch-clamp configuration (whole cell vs i/o patch), the effect of nucleotides on the observed block, the selectivity for channel subtypes, and, finally, the effect of the mutation of SUR2(Y1206S). In the whole cell configuration, glibenclamide und HMR1883 blocked Kir6.2/SUR2x-channels completely at saturating concentrations; PNU-96293, however, induced only a partial block and must be considered a partial antagonist. In i/o patches, the three compounds induced only a partial ((50-70 %) block. This shows that channel species occupied by the blocker can have an open probability >0. The sensitivity of Kir6.2/SUR2 channel block by glibenclamide and HMR1883 to MgADP was investigated. MgADP weakened the block by reducing the potency (but not the efficacy) of the compounds. Regarding the selectivity profile of the different compounds, slight differences were found which depended on the patch-clamp configuration. The mutation Y1206S in SUR2 increased the potency of glibenclamide in blocking the Kir6.2/SUR2 channels ~ 30x (i/o patch, absence of nukleotides); in the whole cell configuration, the effect was smaller. In contrast, the mutation increased the potency of PNU-96293 only 1.7x; this indicated that the binding site of PNU at SUR differs from that of glibenclamide. Regarding KATP channel openers, three aspects were investigated: (i) the opening of Kir6.2/SUR2B channels by openers from different structural families in the absence of MgATP; (ii) the action of the novel dihydropyridine, A312110; and (iii) the opening effect of the stilbene, DIDS. The opening of KATP channels by openers is strongly favoured by MgATP. The signalling chain of this MgATP-dependent pathway involves an opener-induced facilitation of the ATPase activity of SUR and the stabilisation of a posthydrolytic conformation of the protein. On the other hand, some openers at high concentrations can open KATP channels also in the absence of MgATP. Here, I have quantified the opening of Kir6.2/SUR2B-channels by P1075, minoxidil sulfate, diazoxide and nicorandil in the absence of Mg2+. The experiments showed that the different structural classes of openers differed in their efficacy and potency, and that at high concentrations P1075, the MgATP-independent pathway of channel opening contributes up to 20 % to the total effect in the presence of MgATP. The novel dihydropyridine, A312110, proved to be a potent opener of Kir6.2/SUR2A und /SUR2B channels with a potency equal to that of the standard opener P1075 but a slightly reduced efficacy. The stilbene DIDS is known to block KATP channels (KIR6.2 + SUR1, SUR2A and SUR2B) with µM potency. Here, I show for the first time that DIDS, at nM concentrations, was able to open Kir6.2/SUR2B channels; however, opening was observed in only 65 % of the experiments. The activating effect required the presence of SUR (as Kir6.2D26 channels were not activated); in addition, the presence of MgATP was obligatory. The PI-3-kinase inhibitors LY-294002 and wortmannin as well as oleyl-CoA did not affect the activating effect of DIDS suggesting that the channel opening mechanism of DIDS was independent of PIP2/PIP3. In summary, the experiments have shown an intriguing dependence of the effects of KATP channel blockers and openers on the configuration used in the patch-clamp experiments. A second major result is the strong dependence of the drug effects on the presence of Mg2+ salts of nucleotides. The work highlights the complexity of the regulation and modulation of KATP channels which act as metabolic sensors of the cell and which are regulated not only by nucleotides but also by the cytoskeleton and by phospholipids like PIP2 and oleoyl-CoA.

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