Enantiomeranalytik mittels Cyclodextrin-Selektoren in der GC, CEC und CE

Abstract

Im ersten Teil der Arbeit wurde Chirasil-Dex, eine Stationärphase, die meist in der GC eingesetzt wird, untersucht. Chirasil-Dex ist ein Poly(hydromethyl)-dimethylsiloxan, an das permethyliertes beta-Cyclodextrin als chiraler Selektor mittels eines Octamethylen-Spacers chemisch gebunden ist. Der Octenyl-Spacer kann entweder in O-2-, O-3- oder O-6-Position der Glucoseuntereinheit gebunden sein. Daher ergeben sich drei regioisomere Mono(octen-7-enyl)-permethyl-beta-Cyclodextrine und damit das O-2-, O-3- bzw. O-6-Chirasil-Dex. Mittels LC/MS konnte geklärt werden, dass bei der herkömmlichen Synthese fast ausschließlich das O-2-Mono(octen-7-enyl)-beta-CD gebildet wurde. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Veränderung verschiedener Reaktionsparameter, wie Lösemittel, Base und Aufreinigungsschritte, auf die regioisomere Zusammensetzung der Cyclodextrin-Selektoren teilweise stark auswirken kann. Der Vergleich der drei regioisomeren Chirasil-Dex-Polymere bei gaschromatographischen Untersuchungen zeigte, dass die Retentionszuwächse die gleichen Größenordnungen aufwiesen. Prinzipiell wurden keine wesentlichen Unterschiede in den chiralen Trennleistungen festgestellt, jedoch zeigte das O-2- und O-3-Chirasil-Dex in den meisten untersuchten Applikationen etwas höhere Trennfaktoren im Vergleich zu dem O-6-Chirasil-Dex. Dies implizierte eine wichtige Schlussfolgerung: Die Enantioselektivität schien etwas verringert zu sein, wenn der Spacer an die O-6-Position, d.h. an die schmalere Seite der Cyclodextrin-Öffnung gebunden war. Zwischen den O-2- und O-3-Chirasil-Dex-Phasen bestanden nahezu keine Unterschiede.

Auch in der Kapillarelektrochromatographie konnte Chirasil-Dex erfolgreich als Stationärphase zur Trennung atropisomerer PCB mittels o-CEC und p-CEC eingesetzt werden. Ebenso wurden für Chira-beta-Dex-Stationärphasen im p-CEC und rod-CEC Modus Methoden zur Trennung einiger atropisomerer PCB entwickelt. Dabei wurden vor allem in der o-CEC sehr langsame elektroosmotische Flüsse aufgrund der Abschirmung der Silanolgruppen durch das Polymer Chirasil-Dex gemessen. Die hohe Lipophilie der PCB erforderte zudem hohe organische Modifier-Anteile, die zusätzlich zur Reduktion des EOF beitrugen. Somit stellte sich die Trennung der Atropisomere als anspruchsvolles Trennproblem, insbesondere für die o-CEC, heraus. Daher wurde versucht, eine Verbesserung der o-CEC Methode durch direkte Anbindung des Selektors zu erzielen. Da jedoch das Stationärphasenverhältnis für eine Enantiomerentrennung nicht ausreichte, wurde durch ein weiterentwickeltes Anätzungsverfahren die Oberfläche der Kapillarinnenwand stark vergrößert, um die Möglichkeit für eine höhere Selektordichte zu schaffen. Es wurde jedoch gezeigt, das für die Enantiomerentrennungen mit o-CEC-Kapillaren, bei denen der Selektor über freie Silanolgruppen direkt an die Kapillarwand gebunden wurde, keine Verbesserungen des Stationärphasenverhältnisses durch Anätzung erzielt werden konnte.

Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den Hauptwirkstoffen in Ecstasy: 3,4-Methylendioxyamphetamin (MDA), N-Methyl-3,4-methylendioxyamphetamin (MDMA, „Ecstasy“) und N-Ethyl-3,4-methylendioxyamphetamin (MDE). Zur Reinheitskontrolle und zur Feststellung der enantiomeren Verunreinigungen dieser chiralen Amphetaminderivate konnte eine kapillarelektrophoretische Methode entwickelt werden. Hierzu wurde eine Reihe mittels ESI-MS charakterisierter Cyclodextrine und CD-Derivate getestet. Sulfatierte gamma-Cyclodextrine, insbesondere das 14fach sulfatierte hs(XIV)-gamma-CD, erwiesen sich als effiziente Selektoren. Nach Optimierung der Methode konnten die drei Enantiomerenpaare und der interne Standard (3,4-Methylendioxybenzylamin) innerhalb von 20 Minuten simultan getrennt werden. Durch die extrem hohe Auflösung aller Peaks und die vorteilhaften Peakformen, da die ersteluierten (S)-Enantiomere Fronting und die (R)-Enantiomere Tailing aufwiesen, konnte diese Methode zur Bestimmung der Enantiomerenreinheiten von MDA, MDE und MDMA, demnach sechs potentieller enantiomerer Verunreinigungen, eingesetzt werden. Bisher waren für diese Bestimmungen drei verschiedene HPLC-Methoden mit drei unterschiedlichen chiralen Stationärphasen nötig. Außerdem lieferte die neue Methode durch die erhöhte Selektivität, da auch Edukte der Synthese wie z.B. MDA abgetrennt werden konnten, aussagekräftigere Ergebnisse. Die Methode wurde durch ein umfangreiches Validerungsverfahren geprüft. Dabei konnte eine sehr gute Eignung der Methode zum vorgesehenen Zweck festgestellt werden. Erstmals konnte in der CE eine Methode zur Quantifizierung sechs enantiomerer Verunreinigungen validiert werden. Mithilfe der validierten Methode wurden die Produkte unterschiedlicher Syntheseansätze auf ihre Reinheit und Eignung für biologische Tests untersucht.

In the first part of this work Chirasil-Dex was investigated, a stationary phase mostly used in GC. Chirasil-Dex is a poly(hydromethyl)-dimethylsiloxane to which permethylated beta cyclodextrin is chemically bound as chiral selector via an octamethylene spacer. This octenyl spacer can be linked either in O-2-, O-3- or O-6-position of the glucose unit. For this reason there are three regioisomeric mono(octen-7-enyl)-permethyl-beta-cyclodextrins and therefore O-2-, O-3- and O-6-Chirasil-Dex. LC/MS analysis showed that O-2-Mono(octen-7-enyl)-beta-CD was formed almost exclusively in conventional synthesis. Also the strong influence on the regioisomeric composition of the cyclodextrin selectors due to the change of reaction parameters such as solvent, base or clean up steps could be demonstrated. The comparison of the three regioisomeric Chirasil-Dex polymers in gas chromatographic investigations showed the same relative retentions. No striking differences in the chiral separation capabilities could be found, however the O-2- and O-3-Chirasil-Dex exhibited slightly higher enantioseparation factors in comparison to the O-6-Chirasil-Dex in some cases. This implied an important finding: the enantioselectivity seems to be slightly impaired when the spacer originates from the smaller rim oft the cyclodextrin torus. Between the phases of O-2- and O-3-Chirasil-Dex hardly any differences existed.

In capillary electrochromatography Chirasil-Dex could be also successfully employed as a chiral stationary phase in order to separate atropisomeric PCB by o-CEC and p-CEC. Methods for Chira-beta-Dex stationary phases in p-CEC and rod-CEC were developed for the separation of some atropisomeric PCBs as well. Especially in o-CEC very slow electroosmotic flows were detected due to the shielding of the silanol groups caused by the polymer Chirasil-Dex. The high lipophilicity of the PCBs made it necessary to use high contents of organic modifier which lead to a further decrease of the EOF. The separation of the atropisomers turned out to be a challenging task particularly in o-CEC. For this reason the improvement of the o-CEC method by direct binding of the selector to the wall of the capillary was examined. As the ratio of stationary phase was not sufficient for the separation of enantiomers, an improved etching procedure which strongly increased the inner surface of the capillary was employed to create more possible binding sites for the selector. Unfortunately there was no improvement of the ratio of stationary phase by the etching procedure for the separation of enantiomers with o-CEC capillaries in which the selector was directly bound to the capillary wall.

The last part of the work dealt with main agents of ecstasy: 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), N-methyl-3,4-methylenedioxyamphetamine (MDMA, „ecstasy“) and N-ethyl-3,4-methylenedioxyamphetamine (MDE). For the control of purity and for the determination of enantiomeric impurities a capillary electrochromatographic method was elaborated. A number of cyclodextrins and derivatives which were characterized by ESI-MS were tested. Sulphated gamma-cyclodextrins, especially with 14 sulphated groups (hs(XIV)-gamma-CD), turned out to be efficient selectors. After having optimized the method the three pairs of enantiomers and the internal standard (3,4-methylenedioxybenzylamine) could be resolved simultaniously within 20 minutes. Due to the extremely high resolutions of all peaks and the advantageous peak shapes (the first eluted (S)-enantiomers showed fronting and the (R)-enantiomers tailing) the method could be used to determine the enantiomeric purities of MDA, MDE and MDMA according to all six potential enantiomeric impurities. Until now three different HPLC methods including three different chiral stationary phases were required for this analysis. Furthermore the new method provided more exact results due to the higher selectivity, e.g. MDA as an educt could be separated from the products. The method was proven by an extensive validation procedure. The results showed a very good applicability of the method for the given purpose. For the first time a method for quantification of six enantiomeric impurities could be validated in CE. By means of this validated method the purities of the products of different synthetic routes were checked and their qualification for biological tests was examined.