RNA-Transfektion von dendritischen Zellen zur Induktion von antigenspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-16992
http://hdl.handle.net/10900/48738
Dokumentart: Dissertation
Date: 2005
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Rammensee, Hans-Georg
Day of Oral Examination: 2005-04-20
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Dendritische Zelle , Immuntherapie , Killerzelle , RNS , Chronisch-lymphatische Leukämie
Other Keywords:
dendritic cells , immunotherapy , RNA , CTL , CLL
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Inhaltszusammenfassung:

Dendritische Zellen (DC) sind professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC), die bei der Induktion einer antigenspezifischen Immunantwort eine entscheidende Rolle spielen. Kürzlich konnte gezeigt werden, daß mit aus Tumoren isolierter RNA transfizierte DC effektive T-Zell-Immunantworten in vitro und in vivo induzieren können. Der entscheidende Vorteil dieser Vakzinierungsmethode besteht darin, daß zu ihrer Anwendung weder ein charakterisiertes Tumorantigen noch ein bestimmter HLA-Typ des Patienten notwendig ist. Mögliche Nachteile dieser Strategie könnten in der Induktion von Immunantworten gegen körpereigene Gewebsstrukturen (Autoimmunrekationen) bestehen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit evaluierten wir drei verschiedene Methoden zur RNA-Transfektion von DC (Elektroporation, Lipofektion mit dem kationischen Lipid Unifectin M, Transferrinrezeptor-(CD71)-vermittelte Endozytose) hinsichtlich ihrer Effizienz. Bei Experimenten mit in vitro transkribierter EGFP mRNA zeigte sich eine deutliche Überlegenheit der Elektroporation mit einer erzielten Transfektionseffizienz von annähernd 30%, während die beiden anderen Methoden deutlich niedrigere Transfektionseffizienzen lieferten. Die Lipofektion mit Unifectin M ergab eine Transfektionseffizienz von ca. 17.5%, wenn deutlich höhere mRNA-Mengen eingesetzt wurden, während die CD71-vermittelte Endozytose lediglich eine EGFP-Expression in etwa 1% der DC zeigte. Wurden diese verschiedenen Methoden jedoch zur Antigenbeladung von DC vor CTL-Induktion in vitro eingesetzt, erwiesen sich alle drei Techniken als potent bezüglich der Induktion einer antigenspezifischen T-Zellantwort, was als Hinweis darauf verstanden werden kann, daß bereits sehr geringe Transfektionseffizienzen für eine ausreichende Antigenpräsentation durch die DC ausreichend sind. Wir konnten weiter zeigen, daß in vitro transkribierte mRNA zumindest teilweise biologische Aktivität besitzt und für Vakzinierungszwecke eingesetzt werden kann. Ebenso konnten wir mittels eines EGFP-Modelllsystems die Expressionskinetik von nativer und in vitro amplifizierte EGFP mRNA in DC aufklären. Hierbei zeigte sich eine signifikante Expresssion des Proteins bereits wenige Stunden nach erfolgter Elektroporation. Die Expression erreichte nach etwa 40 h ihr Maximum und war bereits nach 48 h wieder auf sehr niedrige Werte zurückgegangen. In den durchgeführten Experimenten konnten wir außerdem zeigen, daß die untersuchte Methode auch zur Induktion von Coloncarcinom-spezifischen T-Zellen eingesetzt werden kann. Im zweiten Teil wurde die erprobte Methode zur Induktion von antigenspezifischen CTL durch RNA-transfizierte Methode auf eine autologes humanes System übertragen, wobei hier die chronisch-lymphatische Leukämie (CLL) als Modellerkrankung ausgewählt wurde. Hierbei konnte gezeigt werden, daß bei Patienten mit B-CLL funktionelle DC aus PBMNC generiert werden können. Diese waren nach Transfektion mit aus Leukämiezellen isolierter RNA in der Lage zytotoxische und proliferative leukämiespezifische T-Zellantworten zu induzieren. In den durchgeführten 51Cr-Freisetzungstests zeigte sich eine spezifisch gegen die CD5+ CLL-Zellen und gegen mit CLL-RNA transfizierte autologe DC gerichtete HLA Klasse I-restringierte Zytotoxizität der CTL, während CD19+CD5- B-Zellen nicht lysiert wurden. In weiteren Experimenten konnten wir eine mögliche Beteiligung eines aus dem tumorassoziierten Antigen Survivin stammenden Peptidepitops an der beobachteten Zytotoxizität nachweisen. Ferner konnten wir auch zeigen, daß auch im autologen System mit RNA-transfizierten DC HLA Klasse II-restringierte T-Helferzellantworten induziert werden können.

Abstract:

Dendritic cells (DC) are professional antigen-presenting cells playing a central role in the induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL). We analyzed the efficiency of tumor RNA transfection into DC using different sources of RNA as well as delivery strategies including electroporation, lipofection and CD71-receptor-based delivery. To evaluate the sensitivity of these approaches, we utilized in vitro transcribed enhanced green fluorescence protein (EGFP)-RNA and whole tumor RNA from EGFP-transfected renal cell carcinoma cell line N43. We demonstrate that electroporation was the most effective way yielding about 30% EGFP positive cells while less than 1% of DC expressed EGFP using the transferrin receptor transfection system. Delivery of RNA with liposomes resulted in 17.5% of EGFP positive cells depending on the RNA amount. However, when these approaches were applied to transduce DC with RNA derived from the A498 cell line for T-cell priming, tumor-specific CTL could be induced using all delivery strategies suggesting that this technology has the potential to induce cytotoxic T-cell response even when low level of antigen is delivered. Furthermore, we demonstrate that amplification of whole tumor messenger RNA (mRNA) as well as the use of total instead of purified mRNA can be utilized for stimulating tumor-specific CTL responses. Additionally, we applied this approach to induce HLA class I- and class II-restricted T-cell responses directed against malignant cells from patients with chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). Here, we show that DCs generated from monocytes of patients with B-CLL induce leukemia-specific cytotoxic and proliferative T-cell responses on transfection with total RNA isolated from autologous leukemic B lymphocytes. Standard 51Cr-release assays showed specific major histocompatibility complex (MHC) class I-restricted cytotoxic activity against the autologous leukemic B cells and DCs transfected with CLL-RNA, whereas nonmalignant B cells were spared. The specificity of the cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response was confirmed using cold target inhibition assays and by blocking HLA class I molecules. The use of DCs transfected with in vitro amplified B-CLL mRNA elicited specific T-cell responses similar to the results obtained with native mRNA. These data suggest that vaccinations using DCs transfected with RNA might be a potent new strategy in the treatment of CLL.

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