Untersuchungen zum Eisenstoffwechsel neuraler Zellen

Abstract

Eisenionen sind als Bestandteil verschiedener Kofaktoren für viele enzymatische Reaktionen wichtig und spielen zum Beispiel eine bedeutende Rolle beim Sauerstofftransport und in der mitochondrialen Atmungskette. In redoxaktiver Form können sie jedoch die Bildung hochreaktiver toxischer Hydroxylradikale verursachen. Diese toxische Wirkung des Eisens wird im Zusammenhang mit der Entstehung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen diskutiert.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten verschiedene Aspekte des Eisenstoffwechsels an Kulturen von Astrocyten, Microglia, Oligodendrocyten und Neuronen untersucht werden. Eisen konnte quantitativ in allen untersuchten Kulturen nachgewiesen werden, wobei Microgliazellen den höchsten spezifischen Eisengehalt aufwiesen. Durch die modifizierte Perlsfärbung zur Detektion von Eisen(III) konnte nur Microgliazellen Eisen(III) zugewiesen werden. Ferritin und Transferrinrezeptoren wurden in allen untersuchten Kulturen nachgewiesen.

Durch histochemische Anfärbungen von Rattengehirnen wurden Eisen und Ferritin überwiegend in Microglia aber auch in Oligodendrocyten nachgewiesen, Transferrinrezeptoren traten vor allem auf Blutkapillaren oder den umgebenen Zellen auf.

Für alle Zellkulturen konnte sowohl eine transferrinabhängige als auch eine transferrinunabhängige Eisenaufnahme nachgewiesen werden, wobei die transferrinunabhängige Aufnahme zu einer wesentlich stärkeren Eisenakkumulation führte.

In Astrogliazellen führte die Inkubation mit Eisen zu einer Steigerung des Vorkommens von Ferritin und zu einer Verringerung des Vorkommens von Transferrinrezeptoren. Inkubation der Zellen mit dem Eisenchelator Deferoxamin steigerte den Transferrinrezeptor-Gehalt, verhinderte bei gleichzeitiger Gabe von Eisen die Eisenakkumulation und führte zur Verhinderung der eisenabhängigen Steigerung des Ferritingehaltes.

Koinkubation von Astrogliazellen mit Eisen und Cycloheximid führte zu einem erhöhten zellulären Eisengehalt ohne Steigerung des Ferritingehalts. Diese Inkubationsbedingungen waren durch starke Bildung von Radikalen und erhöhten Zelltod gekennzeichnet. Die fehlende Steigerung des Ferritingehaltes unter diesen Bedingungen könnte zu einer erhöhten Konzentration redoxaktiven Eisens und damit zur Bildung von Hydroxylradikalen durch die Fenton-Reaktion geführt haben.

Der Vergleich der H2O2-Entgiftungsgeschwindigkeit von Astrogliazellen aus Wildtyp-Mäusen und Glutathionperoxidase 1 (GPx1)-defizienten Mäusen ergab nahezu identische spezifische Entgiftungsgeschwindigkeitskonstanten. In beiden Kulturtypen ergaben sich ähnliche Glutathion-Werte, die durch Inkubation der Zellen mit dem Inhibitor der Glutathionsynthese Buthioninsulfoximin um mehr als 80% verringert wurden. Bei Inkubation mit H2O2 kam es nur in Kulturen von Astrogliazellen aus Wildtyp-Mäusen zur Bildung von Glutathiondisulfid. Die Senkung des Glutathiongehaltes führte nur in Astrogliakulturen aus Wildtyp-Mäusen zu einer Verlangsamung der H2O2-Entgiftung, jedoch wurde bei den Astrogliakulturen beider Mauslinien drei Stunden nach der H2O2-Applikation erhöhter Zelltod festgestellt. Die Hemmung der Catalase durch 3-Amino-1,2,4-triazol führte insbesondere in Astrogliakulturen aus GPx1-defizienten Mäusen zur Verlangsamung der H2O2-Entgiftung. Dies hatte in GPx1-defizienten Astrogliakulturen starken Zelltod zur Folge, während in Astrogliakulturen aus Wildtyp-Mäusen keine erhöhte Freisetzung der Lactatdehydrogenase gemessen wurde. Die Toxizität von H2O2 auf Wildtyp- und GPx1-defizienten Astrogliakulturen nach Vorinkubation mit Buthioninsulfoximin oder 3-Amino-1,2,4-triazol konnte durch Inkubation mit dem Eisenchelator Deferoxamin vollständig verhindert werden. Dies weist darauf hin, dass Eisen an der Toxizität von H2O2 beteiligt ist.

Iron is a component of several cofactors and is therefore important for many enzymatic reactions , like for example oxygen transport and in the mitochondrial respiratory chain. In its redoxactive form, iron can cause the production of highly reactive and toxic hydroxyl radicals. This toxic potential of iron seems to be correlated with the generation and development of different neurodegenerative diseases.

In this thesis, different aspects of iron metabolism of cultured astrocytes, microglia, oligodendroglia and neurons were investigated. Iron (II) was detected in all cultures, with the highest values for microglia. Iron(III) was detected with a modified Perls-Stain and could only be found in microglia cells. Ferritin and transferrin receptors were present in all four cultured cell-types.

Histochemical studies of rat brains shows iron and ferritin mainly in microglia but also in oligodendrocytes. Transferrin receptors were predominantly found on blood capillaries or the surrounding cells.

For all cell cultures a transferrin-dependent and a transferrin-independent iron uptake was found. But in all four cell-types the transferrin-independent iron accumulation was much stronger.

Incubation of astroglia cells with iron led to an increase in the amount of ferritin and to a decrease of transferrin receptors. Incubation of these cells with the iron chelator deferoxamine led to an increase of transferrin receptors, prevented iron accumulation when coincubated with iron and prevented the iron-induced upregulation of ferritin content.

Coincubation of astroglia with iron and cycloheximide led to an increase of intracellular iron content without an increase of feritin content. Under these conditions we found a strong production of radicals and an increase in cell death. Because there was no increase in the ferritin content this could lead to a higher amount of redoxactive iron and then to a higher production of hydroxyl radicals by Fenton reaction.

The comparison of H2O2-detoxification in astroglia cells from wildtype mice and glutathionperoxidase 1 (GPx1)-deficient mice showed nearly identical specific detoxification rates. Both cultures contained the same amount of glutathione, which was reduced with the inhibitor of glutathione synthesis buthioninsulfoximine (BSO) by more than 80%. Only in astroglial cells from wildtype mice incubation with H2O2 led to a production of oxidized glutathione, and a decrease of glutathione led to a reduction of H2O2 detoxification. Three hours after H2O2-application there was an increase of cell death in cultures of both mouse lines. Inhibition of catalase with 3-Amino-1,2,4-triazol led to a slower H2O2 detoxification especially in cultures from GPx1 deficient mice. There was also a higher amount of cell death under these conditions in cultures from GPx1 deficient mice, whereas in astroglial cultures from wildtype mice no increase of the release of lactate dehydrogenase as an indicator for cell death could be observed. The toxicity of H2O2 in wildtype- and GPx1-deficient astroglia cultures after preincubation with buthioninsulfoximine or 3-Amino-1,2,4-triazol was completely prevented by incubation with the iron chelator deferoxamine. This indicates that iron plays a role in the toxicity of H2O2.