Miniaturisierte direktgekoppelte Analysensysteme zur Strukturaufklärung von Carotinoiden und Bestimmung der Bioverfügbarkeit von markiertem Lutein

Abstract

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die gezielte Verwendung von direktgekoppelten Analysensystemen die Beantwortung von sehr komplexen biomedizinischen Fragestellungen ermöglicht. Dabei stellt vor allem die Miniaturisierung der HPLC-NMR-Kopplung zur chromatographischen Trennung und Detektion von sehr kleinen Probenmengen oder geringen Analytmengen in der Probe einen bedeutenden Fortschritt in der instrumentellen Analytik dar. Das für die Bioverfügbarkeitsstudie eingesetzte partiell deuterierte Lutein hingegen zeigt neue Wege und Möglichkeiten auf dem Gebiet klinischer Studien. Die reproduzierbare Herstellung von effizienten Kapillartrennsäulen (250 µm I.D.) stand vor allem am Beginn der Arbeit im Vordergrund. Neben der Optimierung des Slurry-Packprozesses auf die verwendete C30-Trennphase wurde auch eine stabile und universell einsetzbare Endfitting-Technik entwickelt. Durch diese Optimierungen war es nun möglich Kapillartrennsäulen mit einer gleichbleibenden Qualität selber herzustellen, was maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beitrug. Die gepackten Kapillartrennsäulen zeigten im Vergleich zu klassischen HPLC-Trennsäulen gleichwertige und sogar bessere Trenneigenschaften (Trennstärke, Effizienz). Die Bestimmung von Kenngrößen wie z.B. der Nachweisgrenze, die Breite der NMR-Signale oder die Bandenverbreiterung durch Diffusionseffekte des gekoppelten miniaturisierten Systems stand ebenfalls zu Beginn der Untersuchungen mit im Mittelpunkt. Die erhaltenen Werte mit Standardsubstanzen deuteten darauf hin, dass die Untersuchung, Detektion und Strukturbestimmung von mengenmäßig limitierten Analyten aus komplexen biologischen Proben theoretisch möglich sein sollte. Die NMR-spektroskopische Detektion von jeweils weniger als 100 ng (all-E) Lutein und (all-E) beta-Carotin aus einem Standard und später aus 0,5 g Spinat zeigte eindrucksvoll, dass dies auch in der Praxis mit realen Proben umgesetzt werden konnte. Auch der Einsatz des Mikroprobenkopfes ohne on-line HPLC-Kopplung bietet vielfältige Möglichkeiten. So konnten die Strukturen von partiell deuterierten Carotinoiden aus intrinsisch markiertem Gemüse aus nur 0,5 g Probe bestimmt werden. Es zeigte sich, dass die Deuteriumatome gleichmäßig im Molekül eingebaut wurden, unabhängig vom Carotinoid und vom Deuterierungsgrad. Die Deuterierung der Carotinoidmoleküle während der Biosynthese liefert somit ein vollkommen anderes Ergebnis als die Deuterierung im Syntheselabor. Diese Strukturinformation ist vor allem für klinische Studien von Interesse, wo die Carotinoide unter anderem auf ihre Bioverfügbarkeit hin untersucht werden sollten. Neben der cHPLC-NMR-Kopplung zur Strukturaufklärung von Carotinoiden kam die HPLC-MS/APCI-Kopplung zur Detektion von geringsten Carotinoid-konzentrationen in Serum zum Einsatz. Die MS-Kopplung wurde in einer klinischen Studie zur Bestimmung der absoluten Bioverfügbarkeit von Lutein aus Spinat eingesetzt. Zusammen mit der Verwendung von partiell deuteriertem Lutein war es möglich zwischen dem supplementierten Lutein und dem endogenen Serum-Lutein zu unterscheiden. Die Quantifizierung der unterschiedlichen Massenspuren erlaubte die eindeutige Bestimmung der Anreicherung des markierten Luteins im Serum in Abhängigkeit von der Zeit. Mit Hilfe dieser Ergebnisse konnten die absoluten Bioverfügbarkeiten für die Teilnehmer der Studie berechnet werden. Die erhaltenen Werte liegen zwischen 0,5% und 8% und zeigen eine lineare Abhängigkeit mit der Luteinmenge in der Spinatdosis. Um die erhaltenen Werte besser einordnen zu können, sollten noch weitere Studien auch mit anderen Carotinoiden durchgeführt werden. Die Ergebnisse aus diesen Studien sind sowohl für die pharmazeutische als auch für die Lebensmittelindustrie interessant, da Carotinoide sehr oft als Wirk- oder Zusatzstoffe zu verschiedensten Produkten beigegeben werden. Die Entwicklung von kryogenen Probenköpfen stellt neben den solenoiden Mikroprobenköpfen eine weitere Möglichkeit dar, geringe Analytmengen NMR spektroskopisch zu untersuchen. Die Strukturaufklärung von Staphyloxanthin aus Staphylococcus aureus wurde mittels einer solchen kryogenen Plattform durchgeführt. Die bereits seit längerer Zeit postulierte Molekülstruktur konnte nun eindeutig bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass die angenommene alpha-Konfiguration des Zuckers nicht mit den erhaltenen NMR-Daten übereinstimmte. Die Kopplungskonstante des anomeren Protons lag bei 8,4 Hz, was eindeutig auf einen alpha-Zucker hinweist.

In this thesis, a miniaturized hyphenated system has been successfully applied to analyze bio-active substances from complex biological samples. The miniaturization of the on-line coupled HPLC-NMR system for the chromatographic separation and detection of small sample amounts or very low analyte quantities is an important progress in the field of instrumental analysis. Whereas, the use of the partially deuterated lutein in the bioavailability study creates new options and possibilities for clinical studies. Starting point of the scientific work was the reproducible production of efficient capillary columns (250 µm I.D.). One of the most critical point was the development of a stable and all-purpose end fitting technique. This lab-made capillary columns shows equivalent or even better separation efficiency compared to classical 4.6 mm I.D. HPLC-columns. Also the determination of characteristic numbers, like limit of detection, line width of NMR signals or band broadening due to diffusion effects, of the hyphenated system were of major interest in the beginning of the work. The obtained values indicates that the investigation, detection and structure elucidation of quantitative limited analytes from complex biological samples should be possible. The NMR spectroscopic detection of less than 100 ng (all-E) lutein and (all-E) beta-carotene from a standard solution and later on from 0.5 g spinach shows impressively the realization of this standard values into practice with real life samples. Additionally, the application of the micro probe without HPLC coupling (syringe injection) offers manifold prospects. This mode was successfully used for structure elucidation of partially deuterated carotenoids from intrinsically labeled vegetables with a sample requirement of only 0.5 g. All 1H NMR spectra show a random distribution of the deuterium atoms throughout the carotenoid molecules independently from the type of carotenoid, plant material and from the deuterium enrichment. The gained deuteration of the carotenoid molecules during the biosynthesis is in contrast to the deuteration due to a synthetic labeling. This knowledge about the structure is very important for clinical studies, e.g. investigation of the bioavailability of different carotenoids from vegetables. Besides the structure elucidation of carotenoids by capillary HPLC-NMR low carotenoid concentrations in serum were detected by HPLC-MS/APCI. This MS coupling was applied for the determination of the absolute bioavailability of lutein from spinach in a clinical study. The use of the partially deuterated lutein together with the MS detection enabled the differentiation between the supplemented lutein and the endogenous serum-lutein. The quantification of the labeled lutein in serum samples allows the determination of the enrichment for several time points after the a single dose. Due to this results a calculation of the absolute bioavailability for all participants could be achieved. The obtained results are in the range from 0.5 to 8 % and shows a linear dependency with the lutein amount in the spinach dose. Mainly the pharmaceutical and food industry are interested in the results of this study, because carotenoids are active ingredients or additives in many different products. A further development are the cryo probes. This approach enables also the NMR spectroscopic detection of small analyte quantities. The structure elucidation of staphyloxanthin from Staphylococcus aureus was carried out with such a cryo probe and the postulated molecule structure could be confirmed. Only the configuration of the sugar unit had to be change from alpha to beta due to the obtained coupling constant of 8.4 Hz for the anomeric proton.