Strahleninduzierte Aktivierung von TGFß1 und Phosphorylierung von Smad2 im Prozess der terminalen Differenzierung von humanen Hautfibroblasten

Abstract

Hintergrund: Eine wesentiche Spätreation des Normalgewebes in der Strahlentherapie ist die radiogene Fibrose. Das Risiko für die Entstehung einer radiogenen Fibrose steht in direktem Zusammenhang mit dem individuellen Differenzierungsgrad des Fibroblasten-/Fibrozytenzellsystems eines Patienten. Dabei spielt wahrscheinlich die strahleninduzierte terminale Differenzierung von Progenitorfibroblasten zu postmitotischen Fibrozyten eine entscheidende Rolle. Molekularbiologische Untersuchungen lassen vermuten, dass das Zytokin TGF-ß1 bei der Induktion dieses Prozesses zentral beteiligt ist. TGF-ß1-abhängig werden hierbei sehr wahrscheinlich Inhibitoren von Cyclin-abhängigen Kinasen, wie p21, über sogenannte Smad-Proteine aktiviert und die Induktion der Differenzierung ein-geleitet. Material/Methoden: Für die Untersuchungen wurden 8 Haufibroblastenzellstämme (EU2A-EU2H), etabliert von 6 Brustkrebspatientinnen, die eine unterschiedliche Fibrose-manifestation nach Strahlentherapie zeigten, verwendet. Die Zellen wurden entweder konventionell mit Photonen (6 MV) oder mit Kohlenstoffionen (200 MeV/u) bestrahlt. Mit Hilfe des Koloniebildungstests wurde die Dosis-Wirkungsbeziehung der Fibroblasten-zellstämme nach Bestrahlung mit unterschiedlicher Strahlenqualität (Photonenstrahlung, Schwerionenstrahlung) ermittelt. Die Analyse des Differenzierungsmusters der Zellen wurde auf der Basis der Unterscheidung zwischen Progenitorfibroblasten (MF) und postmitotischer Fibrozyten (PMF), sowie innerhalb der Progenitorfibroblastenserie zwischen frühen (E) und späten (L) Progenitorzelltypen vorgenommen. Auf molekularer Ebene wurde mittels RT-PCR, ELISA, Immunpräzipitation und Western-Blot sowohl die strahlenbedingte Aktivierung von LTGFß1 zu TGFß1 als auch die Smad2-Phosphorylierung und p21-Induktion als Funktion der Behandlung mit einem Furin-Protease Inhibitor untersucht. Ergebnisse: Die Überlebenskurven und SF2-Werte nach Photonenbestrahlung variieren deutlich zwischen den individuellen Fibroblastenzellstämmen. Die Analyse des primären Differenzierungsmusters zeigt ebenfalls deutliche Unterschiede zwischen den verschiede-nen Zellstämmen. Nach Photonenbestrahlung ist generell eine Differenzierungsinduktion zu beobachten, die bei den Zellstämmen EU2A und EU2C im Sinne des L:E Verhältnisses am größten ist. Die strahleninduzierte Zunahme des Gehalts an aktivem TGF-ß1 im Medium konnte mit einem spezifischen Inhibitor für die Protease Furin verringert werden. Die Zugabe von aktivem TGFß1 zu Fibroblastenkulturen führte innerhalb von 15 min zu einer TGFß1-Rezeptor-vermittelten Smad2-Phosphorylierung, während nach Bestrahlung die Smad2-Aktivierung erst nach 75 min zu beobachten ist. Auch hier führte die Inhibition von Furin in den bestrahlten Fibroblastenpopulationen zu einer starken Reduktion der Smad2-Phosphorylierung und p21-Induktion und zu einer Reduzierung der strahleninduzierten Differenzierung von Progenitorfibroblasten zu postmitotischen Fibrozyten. Schlussfolgerung: Die strahlenbedingte Aktivierung von LTGFß1 zu TGFß1 und die dadurch vermittelte Induktion des TGFß-Rezeptor-abhängigen Smad-Signalweges scheint die molekulare Voraussetzung für die induzierte terminale Differenzierung und die damit einhergehende Induktion des fibrotischen Phänotyps des Fibroblastenzellsystems zu sein.

Introduction: One severe late effect in radiation oncology is the radiation-induced fibrosis of various normal tissues. As indicated by earlier studies, the individual risk of a patient to develop fibrosis is directly correlated to the principal differentiation pattern of the patients‘ fibroblast/fibrocyte cell system and the radiation-induced terminal differentiation of progenitor fibroblasts to postmitotic fibrocytes. Studies into the cell and molecular biological background indicated that the cytokine TGF-ß1 is the key factor mediating the induction of this process most likely via the activation of Smad-proteins, which are responsible for the up-regulation of cyclin-dependent kinase inhibitors, like p21. Material and Methods: The study was performed on 8 normal skin fibroblast cell strains, which were estalished from 6 breast cancer patients with known, but disclosed risk of fibrosis after radiation therapy. The cell cultures are irradiated either by conventional photon irradiation with linear accelerators (6 MV) or with carbon ions (200 MeV/u). The differentiation pattern was analysed by the determination of the ratio of postmitotic fibrocytes to progenitor fibroblasts, PMF:MF ratio, or the ratio of late to early progenitor fibroblasts, L:E ratio. On the molecular level the activation of latent to active TGF-ß1 and the TGF-ß1-depended acivation of Smad2 and p21 after irradition were analysed as a function of the treatment with a specific furin inhibitor (RT-PCR, ELISA, immunprecipitation and Western blot). Results: The different cell strains show significant differences in the individual radiation sensitivity after conventional photon irradiation and in the pre-irradiation and post-irradiation differentiation status. For all cultures single-dose irradiation resulted in a sig-nificant shift in the differentiation pattern, especially for the cell strains EU2A and EU2C. The radiation-induced increase in the level of active TGF-ß1 could be reduced with the specific furin inhibitor. The treatment of fibroblasts with exogenous TGF-ß1 resulted in a significant phosphorylation of Smad2 after 15 min, whereas post-irradiation Smad2 is activated after 75 min. Inhibition of Furin in the irradiated fibroblasts leads also to a strong decrease of the Smad2 phosphorylation and p21 induction and to a significant reduction of radiation-induced differention of progenitor fibroblasts to postmitotic fibrocytes. Conclusion: The data indicate a major role of the radiation-induced activation of the latent TGF-ß1 complex and phosphorylation of Smad2 in the radiation-induced terminal differentiation and induction of the fibrotic phenotyp of the fibroblast cell system.