Funktionelle Charakterisierung von Mutationen im Synphilin-1- und Parkin-Gen bei der Parkinson-Krankheit : Bedeutung von Proteinaggregation und des Ubiquitin-Proteasomen-Systems für die Pathogenese der Parkinson-Krankheit

Abstract

Die Parkinson-Krankheit (PK) ist die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung beim Menschen. Neuropathologisch ist sie durch den Verlust dopaminerger Neurone in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im Mittelhirn und das Auftreten von Lewy-Körpern (LK) gekennzeichnet. Durch die Identifizierung von Krankheitsgenen, die ursächlich für familiäre Formen der PK sind, konnten neue Einblicke in die Pathogenese der PK gewonnen werden. Die Ergebnisse der nachfolgenden funktionellen Charakterisierung der entsprechenden Genprodukte sprechen dafür, dass Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen sowie Störungen im Ubiquitin-Proteasomen-System (UPS) eine zentrale Rolle bei der Pathogenese der PK spielen. Synphilin-1 wurde als Interaktionspartner von alpha-Synuklein und Parkin, die beide eine Rolle bei der Pathogenese der PK spielen, identifiziert. Ferner konnte dieses Protein als Bestandteil von LK in Gehirnen von Patienten mit sporadischer PK nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue R621C-Mutation im Synphilin-1-Gen, die bei zwei Patienten mit sporadischer PK identifiziert wurde, in vitro funktionell charakterisiert. Die Überexpression von Synphilin-1 in dopaminergen SH-SY5Y-Zellen führte zur Bildung intrazytoplasmatischer Protein-Einschlüsse. Diese Einschlüsse enthielten alpha-Synuklein und Ubiquitin und wiesen damit Merkmale von LK auf. In Zellen, welche die mutierte Form (C621) von Synphilin-1 überexprimierten, wurde unter proteasomaler Hemmung eine im Vergleich zu Wildtyp (Wt)-Synphilin-1-überexprimierenden Zellen signifikant verminderte Bildung von Protein-Einschlüssen beobachtet. Gleichzeitig zeigten C621-Synphilin-1-überexprimierende Zellen eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber zellulärem Stress. Bei der Analyse der differentiellen Genexpression in Wt- und C621-Synphilin-1-überexprimierenden SH-SY5Y-Zellen mittels Affymetrix-Microarray-Technologie konnte in C621-Synphilin-1-überexprimierenden Zellen eine reaktive Hochregulation des Chaperons Hsp70 und des Wachstumsfaktors TGF-beta1 auf transkriptioneller Ebene festgestellt werden. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse die pathogenetische Bedeutung der R621C-Mutation im Synphilin-1-Gen bei der Entstehung der PK und stützen indirekt die Hypothese, dass die Bildung von zytoplasmatischen Protein-Einschlüssen protektiv ist. Durch die Identifizierung der S6-ATPase, einem Bestandteil der regulatorischen 19S-Untereinheit des Proteasoms, als Interaktionspartner von Synphilin-1 konnte erstmals eine direkte Verbindung zwischen Synphilin-1 und dem Proteasomen-System hergestellt werden. Bei der funktionellen Charakterisierung dieser Interaktion in vitro konnte gezeigt werden, dass Synphilin-1 und S6-ATPase in Aggresomen-ähnlichen, intrazytoplasmatischen Protein-Einschlüssen co-lokalisieren. Die Überexpression von Synphilin-1 und S6-ATPase in HEK 293-Zellen führte im Vergleich zu Zellen, die Synphilin-1 alleine exprimierten, zu einer verminderten proteasomalen Aktivität verbunden mit einer signifikant erhöhten Bildung von Synphilin-1-Einschlüssen. Die Steady-State-Level waren allerdings nicht verändert, was für alternative Abbauwege für Synphilin-1 spricht. In nachfolgenden immunhistochemischen Untersuchungen konnte die S6-ATPase als Bestandteil von LK in Gehirnen von Parkinson-Patienten identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für eine direkte Interaktion von Synphilin-1 mit dem regulatorischen Komplex des Proteasoms, welche die proteasomale Funktion moduliert. Es sind eine Vielzahl von Mutationen im Gen, das für das Synphilin-1-interagierende Protein Parkin kodiert, bekannt, die ursächlich für ein autosomal-rezessiv vererbtes Parkinson-Syndrom (PS) mit frühem Krankheitsbeginn sind. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue P159L-Mutation, die bei einer Familie mit offensichtlich dominantem Erbgang für die PK mit spätem Krankheitsbeginn identifiziert wurde, in vitro funktionell analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Überexpression der P159L-Variante in HEK 293-Zellen im Vergleich zu Wt-Parkin zu einer signifikant gesteigerten Bildung von Parkin-Einschlüssen führt. Dies spricht für einen toxic gain of function der mutierten Form, der ursächlich für eine neue, autosomal-dominant vererbte Form des Parkin-bedingten Parkinsonismus mit spätem Krankheitsbeginn ist. Insgesamt stützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese, dass Proteinaggregation und Störungen des UPS eine zentrale Rolle bei der Pathogenese der PK spielen und bieten Angriffspunkte für zukünftige Therapien.

Parkinson's disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder in man. The loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the midbrain and Lewy bodies (LB) are neuropathological hallmarks of the disease. The identification of genes causative for familial forms of PD gave new insights into the pathogenesis of the disease. The results of subsequent functional characterization of the disease genes suggest that misfolding and aggregation of proteins as well as dysfunction of the ubiquitin-proteasome system (UPS) play a central role in the pathogenesis of PD. Synphilin-1 was found to interact with alpha-synuclein and parkin both involved in the pathogenesis of PD. Furthermore, synphilin-1 could be identified as a component of LB in brains of sporadic PD patients. In this thesis a novel R621C mutation in the synphilin-1 gene, which has been identified in two patients with apparently sporadic PD, was functionally characterized in vitro. Overexpression of synphilin-1 in dopaminergic SH-SY5Y cells resulted in the formation of proteinaceous intracytoplasmic inclusions. Similar to LB these inclusions contained alpha-synuclein and ubiquitin. In cells expressing mutant C621 synphilin-1 a significantly reduced number of inclusions was observed compared with cells expressing wild-type (wt) synphilin-1, when subjected to proteasomal inhibition. The reduced number of inclusions in C621 synphilin-1 overexpressing cells was accompanied by an increased susceptibility to cellular stress. Microarray gene expression analysis of C621 and wt synphilin-1 overexpressing SH-SY5Y cells by Affymetrix microarray technology revealed a transcriptional up-regulation of the chaperone Hsp70 and the growth factor TGF-beta1 in C621 synphilin-1 overexpressing cells. Together, these results underline the pathogenetic relevance of the R621C mutation in the synphilin-1 gene to the pathogenesis of PD and support the hypothesis that the formation of cytoplasmic proteinaceous inclusions is cytoprotective. The identification of an interaction between the regulatory proteasomal 19S subunit S6 ATPase and synphilin-1 provides a first direct link between synphilin-1 and the proteasomal system. Functional characterization of this interaction in vitro revealed that synphilin-1 and S6 ATPase colocalize in aggresome like intracytoplasmic proteinaceous inclusions. Coexpression of synphilin-1 and S6 ATPase in HEK 293 cells resulted in a reduced proteasomal activity and a significantly increased formation of synphilin-1 positive inclusions compared with cells expressing synphilin-1 alone. However, the steady-state levels of synphilin-1 were not altered. This result suggests alternative degradation pathways for synphilin-1. Subsequent immunohistochemical studies in brains of PD patients identified S6 ATPase as a component of Lewy bodies. The results of this thesis argue in favor of a direct interaction between synphilin-1 and the regulatory complex of the proteasome modulating proteasomal function. Various mutations in the gene encoding the synphilin-1 interacting protein parkin have been identified to be causative for an autosomal rezessive inherited juvenile parkinsonism. In this thesis a novel P159L mutation, which has been identified in a family with apparently autosomal dominant late onset PD, was functionally characterized in vitro. It could be shown that overexpression of P159L parkin in HEK 293 cells resulted in a signficantly increased formation of parkin positive inclusions compared with overexpression of wt parkin. This argues in favor of a toxic gain of function of the mutant form causative for a novel type of parkin linked autosomal dominant late onset parkinsonism. Together, the results of this thesis support the hypothesis that protein aggregation and dysfunction of the UPS play a central role in the pathogenesis of PD and offer new targets for future therapies.