To cleave or not to cleave - Das Schnittverhalten des 20S-Proteasoms : von der in vitro Analyse zur in silico Modellierung

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die bestehende Datenbasis von proteasomalen Schnittdaten durch die Analyse des in vitro Verdaus von PrP und durch eine große Zahl von Peptidverdaus beträchtlich erweitert. Alle durchgeführten Verdauexperimente wurden quantitativ durch eine Kombination von Edman-Sequenzierung und Massenspektroskopie analysiert. Durch die quantitative Analyse des Verdau von PrP konnten die Unterschiede in den Schnittpräferenzen von konstitutiven und immuno-20S-Proteasomen, die bereits durch Verdau von Hefe Enolase-I erstmals charakterisiert wurden, weiter differenziert und verfeinert werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Unterschiede in der Pathogenität zweier unterschiedlicher PrP-Allele in Schafen mit der proteasomalen Abbaugeschwindigkeit der exprimierten PrP-Varianten korreliert, was den Schluss nahe liegt, dass der proteasomale Abbau von PrP eine wichtige Rolle in der Pathogenese von PrP spielt. In mehreren Peptidverdaus konnte für unterschiedliche CTL-Epitope nachgewiesen werden, ob diese präferentiell durch konstitutive oder immuno-20S-Proteasomen prozessiert werden. Diese Peptidverdaus stellen neben der direkt daraus extrahierbaren Information über die Prozessierung eines speziellen Epitops auch eine wertvolle Datenquelle für die Evaluierung von proteasomalen Schnittvorhersagen dar. Es konnte eine Methode etabliert werden, die den Verdau von weiteren Substraten durch 20S Proteasomen in vitro ermöglicht, damit ist der Grundstein für eine weitere Erweiterung der verfügbaren Daten über die proteasomale Schnittspezifität gelegt, die letztendlich zur Verfeinerung und Qualitätsverbesserung der Vorhersagealgorithmen für proteasomale Schnitte führen wird. Aufgrund der nun vorliegenden Datenbasis von proteasomalen Schnittdaten war eine Entwicklung von Vorhersagealgorithmen möglich, die eine differenzierte Schnittvorhersage von konstitutiven und immuno-20S-Proteasomen erlauben, dies ist insbesondere für die Vorhersage von viralen Epitopen von nicht zu vernachlässigender Bedeutung. Die Vorhersagequalität der in dieser Arbeit entwickelten Methode zu proteasomalen Schnittvorhersage übersteigt die anderer publizierter Algorithmen. Weiterhin konnte durch eine Kombination dieser Algorithmen mit der Vorhersage von TAP-Transport und MHC-Bindung eine kombinierte Vorhersagemethode etabliert werden, die es ermöglicht, den Einfluss der drei höchst-selektiven Prozesse auf die Antigenprozessierung zu modellieren. Die dabei erreichte Vorhersagequalität erreicht Werte von AUC >0.95, was der Vorhersagequalität von SYFPEITHI in den untersuchten Testdatensätzen vergleichbar, in manchen Fällen auch leicht überlegen ist. Diese kombinierte Vorhersage steht für eine Vielzahl unterschiedlicher MHC-Klasse-I Allele zur Verfügung. Mit dem Projekt “Reverse Analysis of Processing“ konnte schließlich die Grundlage für eine Evaluierung des Einflusses flankierender Sequenzen auf die Antigenprozessierung innerhalb einer lebenden Zelle gelegt werden. Das etablierte System ermöglicht eine einfache Analyse des Einflusses sowohl einzelner Aminosäuren als auch der Gesamteinflusses der betrachteten flankierenden Positionen auf die Prozessierungseffizienz durch konstitutive und immuno-Proteasomen. Erste Ergebnisse aus diesem Projekt zeigen bereits eine sehr gute Korrelation des Einflusses der untersuchten flankierenden Sequenzen mit der in MHC Klasse-I-Liganden vorliegenden Aminosäureverteilung. Letztendlich können die aus diesem Projekt gewonnenen Ergebnisse über die Antigenprozessierung in vivo mit in die Entwicklung eines Vorhersagealgorithmus zur Prozessierung von MHC-Klasse-I Liganden miteinfließen und so zu einer weiteren Verbesserung der Vorhersagequalität führen.

In this work, the database of proteasomal cleavage data was substantially extended by the analysis of the digestion of prion protein (PrP) and a large number of peptide digests. All digestion experiments were quantitatively analyzed by a combination of Edman-sequencing and MALDI-mass spectrometry. The quantitative analysis of the proteasomal digestion of PrP allowed further differentiation and refinement of the different cleavage specificities of constitutive and immuno-20S porteasomes, that were first characterized by the analysis of the digesition of yeast enolase-1. Furthermore, it was shown that the differences in the pathogenicity of two different alleles of PrP correlate with the rate of proteasomal digestion of the expressed PrP-variants. This allows the conclusion, that proteasomal degradation plays a role in the pathogenesis of PrP. Using peptide digests, differential processing of multiple CTL-Epitopes by constitutive and immuno-20S-proteasomes could be shown. These peptide digests not only provide information about the processing of a defined CTL-epitope, but are also a valuable source of cleavage data for the development of prediction algorithms for proteasomal cleavages. Additionally, a method was established that allows the digestion of further substrates by 20S proteasomes in vitro, laying the foundation for the growth of the database of proteasomal cleavages, which will finally lead to the improvement of prediction algorithms for proteasomal cleavages. Using the available proteasomal cleavage data, it was possible to develop prediction algorithms that differentiate between cleavages made by constitutive and immuno-proteasomes, which is of special interest for the forecast of viral epitopes. The quality of the established prediction method surpasses all other previously published prediction algorithms. Combining this algorithm with the prediction of TAP-transport and MHC-binding, a prediction method was established that allows to model the influence of the three most selective steps in antigen presentation. The prediction quality reaches AUC-values of >0.95, which is comparable and in some cases better than SYFPEITHI. The combined prediction is available for more than 30 human HLA-alleles on www.mhc-pathwy.net. The project “Reverse Analysis of Processing” provides the basis for the evaluation of the influence of epitope-flanking residues on antigen processing inside living cells. The established system provides a simple way to analyze the influence of single amino acids on the processing efficiency by constitutive and immuno-proteasomes. First results from this project show a very good correlation of the influence of the analyzed flanking residues and their propensities in MHC class-I ligands. The insights into antigen presentation in vivo gained from this project will help to further refine the prediction algorithms for MHC class-I ligands.