Miniaturisierte Trennverfahren und ihre On-line-Kopplung mit der NMR Spektroskopie: Entwicklung und Anwendungen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen die Entwicklung und Anwendung modularer Apparaturen für den flexiblen Einsatz miniaturisierter Trennmethoden wie cHPLC, CEC und Gradienten-(p)CEC vorgestellt. Zum anderen wurde eine Methode weiterentwickelt, die es ermöglicht, frittenlose strapazierfähige (elektro-)chromatographische Kapillarsäulen apparativ einfach und rationell, in reproduzierbarer Qualität herzustellen und dabei eine hohe Variabilität in der Wahl des Packungsmaterials und der Säulenlänge gewährleistet. Im letzten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung der on-line-Kopplung von Kapillartrenntechniken mit der NMR-Spektroskopie beschrieben. Hier gelang zum ersten Mal die splittlose Kopplung mit der cHPLC, CEC und der pCEC. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Konzept zur Herstellung von Kapillarsäulen mit einer Fritte sowie von Kapillarsäulen ohne jegliche Fritte entwickelt. Beide erlauben den Austausch gebrochener UV-Detektionsfenster und eignen sich sowohl zur on-line-Kopplung von CEC, pCEC und cHPLC mit der NMR Spektroskopie, als auch mit der Massenspektrometrie. Ihre Herstellung wurde im Detail beschrieben. Die Qualität der selbst hergestellten (elektro-)chromatographischen Kapillarsäulen wurde mit Hilfe eines Benzoesäureester-Testgemisches überprüft. Dazu wurde eine Serie von van-Deemter-Kurven vermessen, um die Trennleistung der Kapillarsäulen demonstrieren zu können. Des Weiteren wurde der Einfluss des Druckes auf die Trennleistung der pCEC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Trenneffizienzen bei moderaten Drücken durchaus mit denen der reinen CEC konkurrenzfähig sind und Analysen somit in kürzerer Zeit und mit einem stabileren System durchgeführt werden können. Die Vorteile der Gradienten-pCEC gegenüber der HPLC bzw. der cHPLC konnten anhand der Auftrennung eines Mutterkorn-Alkaloid-Extraktes demonstriert werden. Durch die im zweiten Teil dieser Arbeit vorgestellte Entwicklung der Kopplung der cHPLC, CEC und pCEC mit der NMR-Spektroskopie konnte die Einsatzfähigkeit miniaturisierter Trennverfahren zur on-line Strukturaufklärung aufgezeigt werden. Mit den im Rahmen dieser Arbeit entwickelten modularen Apparaturen und der Entwicklung verbesserter Detektionskapillaren gelang zum ersten Mal die splittlose on-line-Kopplung kapillarer Trennsysteme mit der NMR-Spektroskopie. Das Kernstück des in dieser Arbeit entwickelten Systems war die speziell dafür entwickelte druckstabile Detektionskapillare mit hoher Symmetrie und vergrößertem Detektionsvolumen, welche eine sichere und einfache Handhabung gewährleistet, eine deutlich gesteigerte Empfindlichkeit aufweist und einen einfachen Wechsel zwischen den verschiedenen Trennmethoden erlaubt. Die höhere Trennleistung der CEC gegenüber der cHPLC und die gesteigerte Sensitivität des neuen Setups im Vergleich zum Alten wurde durch die Untersuchung von Benzoesäureestern und Fettsäuremethylestern demonstriert. Aufgrund der besseren Auflösung und der schärferen Peaks war es möglich, 2D-Spektren der Reinsubstanzen aufzunehmen. Aufgrund des verbesserten neuen Setups gelang es, die Analysenzeiten bei verbesserter Trennleistung und gesteigerter Empfindlichkeit drastisch zu verkürzen. Anhand von Beispielsubstanzen konnte auch das Potential der on-line-Kopplung kapillarer Trennsysteme mit der NMR–Spektroskopie in der Zucker- und Enantiomeren-Analytik aufgezeigt werden. Eine Möglichkeit das im Vergleich zur HPLC/NMR-Kopplung immer noch höhere Detektionslimit weiter abzusenken, ist die Durchführung von stopped-flow Experimenten. Diese sind vor allem zur Aufnahme von 2D-Spektren unabdingbar, da sie die dazu notwendigen Messzeiten auf einem Substanzpeak ermöglichen. UV-Untersuchungen zur Möglichkeit von stopped-flow Experimenten mit Kapillartrennmethoden während eines on-line Laufes zeigten keine nennenswerten Bandenverbreiterungen mit dem vorgestellten Setup, so dass diese Möglichkeit nahezu uneingeschränkt zu verwenden war. Das System war mit Hilfe der stopped-flow Messungen empfindlich genug, um reale Proben, wie in Käferdrüsen- oder Pflanzen-Extrakten enthaltene Wirkstoffe aufzutrennen, zu detektieren und ihre Struktur aufzuklären. Insgesamt verdeutlichen die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente das große Potential der miniaturisierten Trennverfahren, vor allem das der druckunterstützten Elektrochromatographie, sowohl mit UV-Detektion, als insbesondere auch bei NMR-Kopplungsexperimenten. Die Untersuchungen der Modellsubstanzen wie auch die der Naturstoffproben demonstrieren die Leistungsfähigkeit dieser Methoden. In allen Fällen konnte gezeigt werden, dass die (p)CEC gegenüber der cHPLC eine höhere Trennschärfe aufweist und kürzere Analysenzeiten ermöglicht.

The first part of this work was focussed onto the development of a routinely usable modular system for most flexible operation of miniaturized separation techniques (e.g.: capillary high performance liquid chromatography (cHPLC), capillary electrophoresis (CE), capillary electrochromatography (CEC), and pressurized capillary electrochromatography (pCEC)). Furthermore, this part deals with the development of robust fritless high performance capillary columns, which are reproducible and easy to prepare, enabling the preparation of capillary columns with the nowadays widespread variety of packing material. The excelent performance of these fritless columns is demonstrated. Examples of isocratic/gradient cHPLC-, CE-, CEC- and pCEC-separations are given. Additionally, pure CEC is compared with pCEC with respect to separation efficiency vs. robustness an separartion speed. The second part of this work deals with on-line coupling of cHPLC, CEC and pCEC with nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), demonstrating the suitability of these hyphenated techniques for on-line structure elucidation. To enhance sensitivity, enabling easy switching in between the different separation techniques, a modular hyphenated set-up was developed in combination with a highly symmetrical and pressure stable detection cell. The sensitivity enhancement and peakshape improvement compared to former setups is demonstrated. Examples for on-line and stopped-flow 1D- and 2D-experiments are given. Finally, the full performance of this new setup is proven by real samples - on-line separated, detected and identified via these hyphenated techniques.