Aufbau und Charakterisierung eines miniaturisierten parallelen optischen Detektionssystems zur Untersuchung von Oligonukleotiden

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-14378
http://hdl.handle.net/10900/48665
Dokumentart: Dissertation
Date: 2004
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Gauglitz, Günter
Day of Oral Examination: 2004-10-21
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Miniaturisierung , Spektroskopie , DNS , Detektion , Parallelisierung
Other Keywords: RIfS , Oligonukleotide , Reflectometrische Interferenzspektroskopie
RIfS , oligonucleotid
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Inhaltszusammenfassung:

Seit der vollständigen Entschlüsselung des menschlichen Genoms im April 2003 hat für die Biotechnologie unwiederbringlich eine neue Ära begonnen, die sogenannte Post-Genom- Ära. Mit der DNA-Diagnostik in der Genom-Ära kann ein direkter Nachweis von Krankheitserregern (Mikroorganismen oder Viren) erfolgen. Was eine Nachweiszeit von einigen Tagen benötigte, kann auf wenige Stunden reduziert werden, was auch dadurch bedingt ist, dass Mikroorganismen nicht mehr in Reinkulturen vermehrt werden müssen, sondern direkt anhand der spezifschen Nukleinsäuresequenz eines Krankheitserregers mit Hilfe einer Gensonde nachgewiesen werden können. Große Vorteile ergeben sich gerade bei solchen Infektionskrankheiten, bei denen der Nachweis über die Antikörperbildung bislang schwierig bzw. langwierig war, z.B. HIV (Aids), Hepatitis-B-Viren (Leberentzündung), Mycobacterium tuberculosis (Tuberkulose) ebenso wie Mycoplasma pneumoniae (Lungenentzündung) und andere Bakterien, welche Äuber ihre DNA bzw. RNA diagnostiziert werden (GeneChip-Systeme, Affimetrix). Trotz dieser Erfolge auf dem Gebiet der DNA-Diagnostik sind viele Nachweiskonzepte ungeeignet für eine analytische Anwendung, da die industrielle Forschung im Vergleich zur medizinischen noch sehr teuer ist. Oft fehlt es den Sensoren an der Selektivität bezüglich der Oligonukleotiden mit Punktmutationen, der Reproduzierbarkeit der Messergebnisse und der Sensor-Arrays. Daher spielen Forschungs- und Entwicklungsarbeiten auf dem Gebiet der DNA-Biosensorik trotz der angebrochenen Post-Genom Ära weiterhin eine wichtige Rolle bei der analytischen Erfassung von Nukleinsäuresequenzen, wie aktuelle Forschungen auf dem Gebiet der parallelen markierungsfreien Punktmutationsdetektion zeigen. Das Ziel des BMBF-Verbundprojekt Gensensorik war, den Nachweis von Sequenzen in eine analytisch und industriell verwertbare Form zu bringen. Dabei sollte ein sogenannter Gensensor für die Detektion pathogener Keime, Umweltanalytik und Forensik eingesetzt werden. Grundlage des Gensensor-Chips sind low-density Mikroarrays, die nicht mehr als ca. 1000 Rezeptorsequenzen zur Analytik bereithalten. Hierbei gliederte sich das Gesamtprojekt in die Bereiche Hardware, Software und Anwendung, wobei ein Schwerpunkt dieser Arbeit innerhalb des Teilprojekt zur Verbesserung und Miniaturisierung der Detektionseinheit liegt. Ein zweiter liegt im Verständnis der temperaturabhängigen Signale der Detektionseinheit, welche die temperaturabhängigen Oligonukleotidwechselwirkungen beinhalten. Die DNA-Biosensoren heben sich in drei Hauptcharakteristika voneinander ab: der Immobilisierungsstrategie, der Detektionsmethode und dem Nachweisassay. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Informationstiefe eines Biosensor-Experimentes bezüglich der genauen Charakterisierung einer biomolekularen Wechselwirkung mit einer hohen Parallelität zu verbinden. Um dieses Ziel zu erreichen war es notwendig, alle Einzelkomponenten des Gesamtaufbaus zu analysieren, um zu verstehen, welche Komponente zu welchem Anteil die Signaltiefe beeinflusst. Da es den Biosensor-Messungen jedoch nicht an Informationsgehalt, sondern vielmehr an Parallelität fehlt, liegen die Schwerpunkte dieser Arbeit bei der Immobilisierungsstrategie und der Detektionsmethode. Oft wird bei den derzeit verwendeten parallelen Biosensoren im Bereich der Nachweisassays die Signalverstärkung genutzt - sei es durch Probenvorbereitung (Polymerase Kettenreaktion, engl. Polymerase Chain Reaction; PCR) oder durch Markierung der Zielsequenzen. In dieser Arbeit war die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) als Detektionsmethode Ausgangspunkt für die Sequenzuntersuchungen. Der Vorteil dieser direkt optischen Methode liegt zum einen in der zeitaufgelösten Beobachtung einer biomolekularen Wechselwirkung (im Vergleich zur statischen Endpunktbestimmmung z.B. von FluoreszenzintensitÄaten), zum anderen in der Markierungsfreiheit; dadurch fallen Probenvorbereitung und Markierung weg. Da sich RIfS für die parallel optische Detektion eignet, wie in früheren Messungen gezeigt werden konnte, ist diese Methode eine vielversprechende Wahl für die Entwicklung eines miniaturisierten, parallel optischen Biosensors. Ein weiteres Argument für RIfS ist der Umstand, dass es gegenwärtig noch keinen markierungsfreien parallelen DNA-Sensor am Markt gibt. Das kommerziell erhältliche Gerät mit ähnlicher Zielsetzung, wie das Biacore 3000 ist auf 8 Kanäle beschränkt und das FLEX-CHIP-System von HTS Biosystems kann keine Moleküle unter 8000 Dalton Molekulargewicht detektieren, womit die zeitaufgelöste Analyse von Sequenzdaten erschwert wird, da bei längerkettigen Molekülen elektrostatische Wechselwirkungen hinderlich wirken können. Nach Danzer ist Analytik ein Prozess, um Erkenntnisse und Informationen aus Signalen zu gewinnen, die durch molekulare Wechselwirkungen entstehen. Analytisch ist die vorliegende Arbeit in zweifacher Hinsicht. Ziel der Arbeit war es zum einen, den analytischen Prozess (Prozess A) in einem Gerät zu etablieren. Um jedoch diesen Prozess zu verstehen und effzient zu verbessern, ist es zum anderen notwendig, genau diesen ersten Prozess einem weiteren analytischen wissenschaftlichen Prozess (Prozess W) zu unterziehen. Ein Großteil dieser Arbeit wird sich mit dem Prozess W beschfaftigen, wobei diesem Dokument der Prozess A als Strukturelement dient. In den einzelnen Kapiteln nimmt - bezüglich der analytischen Erkenntnis - die Informationstiefe ab, da wir aus rohen Daten (maximal enthaltene Information nach Shannon) zu Informationen über die molekularen Interaktionen gelangen.

Abstract:

This thesis describes the development and characterisation of an optical label-free device for oligonucleotid-detection. It analyses the limit of detection and the sensitivity of the method and device. It concludes that a parallel label-free optical device is a good low-cost setup for (bio-)molecular interaction-analysis.

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