Characterization of new putative amino acid transporters of the ATF1 superfamily in Arabidopsis thaliana

Abstract

The uptake of nitrogen and its translocation in the plant involve the transport of organic nitrogen in the form of amino acids. During the last years, the focus of the studies on amino acid transport in plants moved from biochemical to molecular characterization of the carrier proteins required for this process. Not all the predicted transport fluxes through the membranes of plant cells have already been assigned to a particular carrier protein, although many carrier proteins were functionally characterized. Moreover, many other proteins, whose existence was predicted by genome sequencing and large scale EST projects, were suggested to function as amino acid transporters on the base of sequence similarity and predicted structural features. However, many of such putative transport proteins have not yet been functionally characterized. In this study a group of related Arabidopsis genes encoding putative amino acid transporters have been analyzed in detail. The in silico analysis grouped these genes to the ATF1 superfamily, suggesting a function as amino acid transporters. These proteins have been called AT, for Amino acid Transporters. Attempts to study these proteins by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and complementation of yeast mutants defective in amino acid uptake, did not allow their functional characterization. The AT proteins are closely related to the yeast AVTs, that have been described as vacuolar transporters of amino acids. Thus, a hypothesis was raised that the AT proteins act as intracellular transporters of amino acids, located on the tonoplast. A yeast mutant strain, G119, was constructed to study vacuolar asparagine transporters which requires further optimization. The subcellular localization of AT1 and AT12 was determined by fusions with GFP and expression in Arabidopsis protoplasts. In these assays, both AT1 and AT12 were localized in endomembranes. Therefore, an alternative hypothesis on the function of the AT proteins was postulated: they may act as vesicular transporters of amino acids, involved in export processes from the cell, in a similar way to the mechanism suggested for the phylogenetically related RnVGAT, exporter in rat synapsis. To provide evidence for the possible physiological processes in which these proteins are involved, the activity of the promoter of AT4, AT5, AT9 and AT12 was analysed by promoter-GUS fusions. AT4 was expressed in the hypocotyl and in the petiole of young leaves and might play a role during the rapid cell elongation found in these organs. AT5 was not expressed under standard growth conditions. AT9 and AT12 were expressed in cotyledons and young leaves, suggesting a role in the supply of nitrogen to sink organs in young seedlings. They were also expressed in the pollen, therefore these proteins might have a role in the gametogenesis. AT9 was in addition also expressed in roots of developing seedlings and in the lateral roots of adult plants. A role of AT9 in the uptake of amino acids from the soil can therefore be postulated. The analysis of T-DNA insertion lines has revealed that the knock-out mutants in the AT7 gene are sterile. This might suggest an essential role of AT7 in the gametogenesis.

Die Aufnahme und Verteilung von Stickstoff in Pflanzen beinhaltet den Transport von organischem Stickstoff in Form von Aminosäuren. In den letzten Jahren hat sich der Schwerpunkt der Forschung im Bereich des Aminosäuretransports von biochemischen Studien in Richtung der molekularen Charakterisierung an diesem Prozess beteiligter Transportproteine verschoben. Noch wurden nicht alle vorhergesagten Transportströme durch die Zellmembranen von Pflanzen einem bestimmten Protein zugeordnet. Viele Transportproteine wurden funktionell charakterisiert. Vielen anderen Proteinen, deren Existenz durch genomisches Sequenzieren und EST Projekten vorhergesagt wurde, kann aufgrund von Sequenzenähnlichkeiten und strukturellen Merkmalen eine Funktion als Aminosäuretransporter zugeordnet werden. Viele dieser Proteine sind zurzeit noch nicht charakterisiert. In dieser Arbeit wurden einige Gene aus Arabidopsis detailliert analysiert, die vermeintlich Aminosäuretransporter kodieren. Die in silico Analyse ermöglichte, diese Gene der ATF1-Überfamilie zuzuordnen und eine Funktion als Aminosäuretransporter vorherzusagen. Diese Proteine wurden AT genannt, für Aminosäuretransporter. Versuche, die Funktion dieser Proteine durch heterologe Expression in Saccharomyces cerevisiae und Komplementation von Hefemutanten, deren Aminosäureaufnahme gestört war, zu bestimmen, haben keine funktionelle Charakterisierung ermöglicht. Die AT Proteine sind eng verwandt mit den AVTs in Hefe, die als vakuoläre Aminosäuretransporter beschrieben wurden. Eine Hypothese zur Funktion der Gene ist also, dass die AT-Proteine als intrazelluläre Aminosäuretransporter agieren und im Tonoplasten lokalisiert sind. Eine Hefemutante, G119, wurde hergestellt, um vakuolären Asparagintransportern zu untersuchen was weiterer Optimierung bedarf. Die subzelluläre Lokalisierung von AT1 und AT2 wurde durch Fusionen mit GFP und Expression in Arabidopsis Protoplasten bestimmt. Diese Untersuchungen zeigten, dass AT1 und AT12 in Endomembranen lokalisiert sind. Daher wurde eine alternative Hypothese der Funktion dieser Proteine aufgestellt: Sie könnten als vesikuläre Aminosäuretransporter am Exportsystem der Zelle beteiligt sein, ähnlich dem Mechanismus, der für die phylogenetisch verwandten RnVGAT, Exporter in Rattensynapsen, vorgeschlagen wurde. Um Beweise für die möglichen physiologischen Prozesse zu finden, an denen diese Proteine beteiligt sind, wurde die Promotoraktivität von AT4, AT5, AT9 and AT12 durch Promotor-GUS-Fusionen untersucht. AT4 wurde im Hypokotyl und in den Petiolen junger Blätter exprimiert und könnte während der schnellen Zellstreckung dieser Organe eine Rolle spielen. AT5 wurde unter Standardbedingungen nicht exprimiert. AT9 und AT12 werden in Keimblättern und jungen Blättern exprimiert, was für eine Rolle bei der Stickstoffversorgung von Sinkorganen junger Keimlinge spricht. Sie werden außerdem im Pollen exprimiert und könnten eine Rolle bei der Gametogenese spielen. AT9 wird zusätzlich in Wurzeln sich entwickelnder Keimlinge und in den Lateralwurzeln adulter Pflanzen exprimiert. Daher kann eine Rolle bei der Aufnahme von Aminosäuren aus dem Boden postuliert werden. Die Analyse von T-DNA-Insertionslinien zeigt, dass Linien, die eine Knock-Out-Mutation im AT7-Gen tragen, steril sind. Das spricht für eine essentielle Rolle dieses Gens während der Gametogenese.