Characterization of a novel family of nucleobase transporters

Abstract

Salvaging of nucleobases from storage tissues plays an important role in providing nucleobases to cells which are unable to synthesize sufficient amounts for their needs, e.g. during early phases of seedling development, when cells divide rapidly. Cellular uptake systems for pyrimidines have been described so far, but in higher eukaryotes, transporters of thymine and uracil have not been characterized. AtUPS1 and PvUPS1 were recently identified as transporters of allantoin in Arabidopsis and French bean, respectively. However, in contrast to tropical legumes, Arabidopsis mainly uses amino acids for long distance transport. Allantoin transport has not been described in Brassicaceae. Thus, the physiological substrates of UPS transporters in Arabidopsis may be compounds structurally related to allantoin. The Arabidopsis genome encodes five UPS transporters. For a better understanding of the role of members of the AtUPS family, different members were characterized in this work by (i) detailed investigation of substrate specificities when expressed in Xenopus oocytes (AtUPS1, 2), (ii) analysis of transport mechanism and regulation (AtUPS1, 2, 5), (iii) analysis of expression pattern in plants by promoter-GUS studies and RT-PCR, and (iv) investigation of transgenic plants deficient or lower in expression of AtUPS members due to T-DNA insertions or PTGS (post transcriptional gene silencing) (AtUPS1, 2, 5). AtUPS1 and AtUPS2 have broad substrate specificities covering cyclic purine degradation products as well as pyrimidines. Moreover, they both mediated high-affinity transport of uracil (~ 6 µM). AtUPS1 and AtUPS2 seemed to transport uncharged substrates by H+-cotransport. With the exception of AtUPS2, a nucleotide-binding domain (Walker A motif) is predicted in the UPS sequences. It might have a role in the regulation of transport mediated by AtUPS proteins. In addition, two splicing variants of AtUPS5 were cloned and analyzed (AtUPS5 and a shorter variant, AtUPS5s). AtUPS5 also mediated the transport of allantoin, uracil and other heterocycles. AtUPS5s might be involved in the regulation of transport mediated by AtUPS5 by interaction or complex formation with UPS5, since coexpression of both proteins in yeast decreased the transport efficiency of AtUPS5 significantly. Moreover, the expression patterns of members of the AtUPS family suggest functions in nucleobase salvaging, for example the high expression of AtUPS1 during germination and the early stages of seedling development. AtUPS4 might play a role in uracil supply to pollen. AtUPS2 and AtUPS5 might serve the long-range transport of nucleobases and possibly the transport involved in cellular turnover. In addition, expression of members of the AtUPS family was elevated in plants grown under conditions that can lead to nucleotide deficiency (nitrogen deficiency, salt stress). Arabidopsis ups2 and ups5 T-DNA insertion mutants and ups1 lines, in which transcript levels were reduced by PTGS, were more tolerant to (5-fluorouracil) 5-FU, compared to the wild type. The results suggest that in Arabidopsis UPS transporters are the main transporters of uracil and potentially other nucleobases, whereas during evolution legumes may have taken advantage of the low selectivity of UPS proteins for the long distance transport of allantoin. Nevertheless, for a detailed understanding of the transport of nucleobases and derivatives in plants, knowledge about their cellular and subcellular concentrations under dynamic conditions of living plant cells is necessary. Therefore, as a starting point for the imaging of nucleobases in plant cells, a FRET-based sensor for the purine hypoxanthine was developed and tested in vitro.

Nucleotide sind essentielle Metaboliten aller Zellen. Insbesondere, wenn ihre Neusynthese nicht ausreicht, um den zellulären Bedarf zu decken, spielt die Wiederverwertung vorgefertigter Nucleobasen eine wichtige Rolle. Dies ist häufig der Fall aufgrund erhöhter Zellteilungsaktivität, z.B. während der frühen Keimlingsentwicklung. Obwohl die Aufnahme von Pyrimidinen in Zellen beschrieben worden ist, sind bisher keine Uracil- oder Thymintransporter höherer Eukaryoten charakterisiert worden. Vor kurzem sind AtUPS1 (aus Arabidopsis thaliana, Ackerschmalwand) und PvUPS1 (aus Phaseolus vulgaris, Gartenbohne) als Transporter für Allantoin identifiziert worden. Im Gegensatz zu vielen Bohnenarten transportiert Arabidopsis organischen Stickstoff jedoch überwiegend als Aminosäuren. Da in Brassicaceae bisher kein Transport von Allantoin beschrieben wurde, ist denkbar, dass hier eine strukturell ähnliche Verbindung das eigentliche physiologische Substrat sein könnte. Insgesamt kodiert das Arabidopsis Genom für fünf UPS Transporter. Um die Funktion der AtUPS Familie besser zu verstehen, wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Mitglieder charakterisiert durch (i) detaillierte Untersuchung der Substratspezifitäten in Xenopus Oocyten (AtUPS1, 2), (ii) Analyse des Transportmechanismus und der Regulation verschiedener UPS Proteine (AtUPS1, 2, 5), (iii) Analyse der Expression in Pflanzen durch Promoter-GUS Studien und RT-PCR (AtUPS1-5) und (iv) Untersuchung transgener Pflanzen mit fehlender oder verminderter Expression einzelner UPS durch T-DNA Insertionen oder PTGS (post-transcriptional gene silencing) (AtUPS1, 2, 5). AtUPS1 und 2 transportierten eine Vielzahl strukturell ähnlicher Purin-Abbauprodukte und auch Pyrimidine. Sie hatten ausserdem beide eine hohe Affinität zu Uracil (~ 6 µM). Zudem hatten AtUPS1 und AtUPS2 den gleichen Transportmechanismus: sie scheinen ungeladene Substrate durch H+-Cotransport zu transportieren. Im übrigen ist eine Nucleotid-Bindedomäne (Walker A Motiv), die eine regulatorische Funktion ausüben könnte, in allen AtUPS-Sequenzen ausser AtUPS2 vorhergesagt. Zwei Splicing-Varianten von AtUPS5 wurden kloniert und analysiert. Während AtUPS5 auch Allantoin, Uracil und andere Heterocyclen transportiert, könnte AtUPS5s, die kürzere Splicing-Variante von AtUPS5, durch Interaktion mit AtUPS5 an einer Regulation des Transports beteiligt sein. Die Transportrate von AtUPS5 wurde durch eine Co-Expression mit AtUPS5s in Hefe deutlich verringert wurde. Das Expressionspattern verschiedener AtUPS Transporter könnte darüber hinaus auf Aufgaben im Nucleobasen-Recycling hinweisen, wie z.B. die hohe Expressionsraten von AtUPS1 während früher Stadien der Keimlingsentwicklung. AtUPS4 könnte an der Versorgung von Pollen mit Uracil beteiligt sein, während AtUPS2 und AtUPS5 sowohl eine Rolle im Langstrecken-Transport von Nucleobasen als auch im Transport auf zellulärer Ebene spielen könnten. Auch unter Stressbedingungen, die Nucleotiden-Mangel auslösen können (Stickstoff-Mangel, Salz Stress) war die Expression verschiedener UPS erhöht. Darüber hinaus wurde gefunden, dass T-DNA Insertionslinien von UPS2 und UPS5, sowie Linien mit erniedrigtem UPS1 mRNA Level (PTGS-Linien) toleranter gegenüber 5-Fluorouracil (5-FU) sind als der Wildtyp. Dies impliziert, dass UPS in Arabidopsis wichtige Transporter für Uracil und eventuell andere Nucleobasen sein könnten, während sich Bohnen die geringere Selektivität gegenüber Substraten für den Allantointransport zu nutze gemacht haben. Um jedoch den Transport von Nucleobasen und Derivaten in Pflanzen detailliert zu verstehen, ist eine Bestimmung ihrer dynamischen zellulären und subzellulären Konzentrationen notwendig. Als Ausgangspunkt zur weiteren Entwicklung und Optimierung von Nucleobases Sensoren wurde daher ein auf FRET-basierender Hypoxanthin-Sensor entwickelt und in vitro getestet.